超高效液相色譜法測定煙用香精中的歐前胡素

王雪瑩 陸舍銘 朱 麗 孟昭宇 曹秋娥

（1.紅塔煙草集團有限責任公司技術中心，玉溪 653100； 2.云南大學化學科學與工程學院，昆明 650091）

超高效液相色譜法測定煙用香精中的歐前胡素

王雪瑩1，2陸舍銘1朱 麗1孟昭宇1曹秋娥2

（1.紅塔煙草集團有限責任公司技術中心，玉溪 653100； 2.云南大學化學科學與工程學院，昆明 650091）

建立了測定煙用香精中歐前胡素的超高效液相色譜方法。以體積比為1∶1的乙腈-水溶液為萃取劑，采用ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱，柱溫為30℃，流動相為乙腈-水，進行梯度洗脫，流速為0.2 mL／min，檢測波長為248 nm，對20種煙用香精樣品進行測定。歐前胡素的檢出限為0.039 5 μg／g，在0.16～8.00 mg／L范圍內歐前胡素濃度與色譜峰面積呈良好的線性關系(r=0.999 9)。歐前胡素測定結果的相對標準偏差為0.68%～2.97%(n=6)，回收率為90.83%～97.85%。

超高效液相色譜法 煙用香精 歐前胡素

歐前胡素是一種香豆素類化合物，廣泛存在于中草藥及中成藥之中［1-6］，具有抗菌、平喘、抗過敏及解痙鎮痛等作用［7］。卷煙中添加煙用香精能夠改善卷煙吃味，提高卷煙品質，目前越來越多的天然原料提取香精應用于食品工業和化妝品等日用化工工業中。為了進一步了解煙用香精有必要對其中的歐前胡素進行檢測。

目前報道的歐前胡素的檢測方法主要為紫外分光光度法［8］、薄層掃描法［9，10］、高效液相色譜法［11-16］、液相色譜-質譜法［17，18］、氣相色譜-質譜法［19，20］等。超高效液相色譜法具有靈敏度高、精密度好、分析速度快、重現性好等優點，因此筆者建立了測定煙用香精中歐前胡素的超高效液相色譜法。該法準確、簡便、快速，能滿足煙用香精的實際檢驗要求，適合批量煙用香精樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：ACQUITY UPLCTM型，配備真空脫氣機、二元梯度泵、自動進樣器、恒溫柱箱、TUV檢測器和色譜工作站，美國Waters公司；

超純水儀：Millipore RiOs型，美國Millipore公司；

電子分析天平：PG503-S型，感量0.1 mg，瑞士Mettler公司；

超聲清洗儀：KQ700DB型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國TEDIA公司；

歐前胡素：標準品，99.6%，中國藥品生物制品檢定所；

冰乙酸：分析純，99.5%，中國醫藥集團上海化學試劑有限公司；

20種煙用香精樣品：紅塔煙草集團；

0.22 μm水系濾膜、0.22 μm有機系濾膜：福建福州藍龍過濾器材有限公司；

歐前胡素標準儲備液：400.00 μg／mL，準確稱取0.010 0 g（ 精確至0.000 1 g）歐前胡素標準品，使用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻；

實驗用水為二次石英蒸餾水，經Millipore超純水儀處理，電阻率不小于18.2 MΩ·cm，使用前經0.22 μm水系濾膜過濾。

1.2 樣品前處理

準確稱取0.50 g（精確至0.000 1 g）煙用香精樣品，置于50 mL錐形瓶中，準確加入10 mL體積比為1∶1的乙腈水溶液，于室溫下超聲萃取40 min。將萃取液經0.22 μm有機系濾膜過濾后移入2 mL樣品瓶，進行超高效液相色譜分析。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-水；梯度洗脫條件：0～5.0 min，10%～30%乙腈；5.0～25.0 min，30%～70%乙腈；25.0～28.0 min，70%乙腈；28.0～29.0 min，70%～10% 乙腈；29.0～30.0 min，10%乙腈；流速：0.2 mL／min；檢測器：TUV；檢測波長：248 nm；柱溫：30℃；樣品室溫度：4℃；進樣量：10 μL。

1.4 色譜圖

在1.2色譜條件下，對標準樣品和煙用香精樣品進行分析檢測，采用保留時間定性，外標法定量，歐前胡素標準工作溶液色譜圖見圖1。

圖1 歐前胡素標準工作溶液的UPLC色譜圖

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

（1）流動相的選擇和洗脫梯度的優化

實驗中嘗試采用不同的流動相進行分離分析，其中包括甲醇-水、乙腈-水、甲醇-冰乙酸水溶液（其中冰乙酸的體積分數分別為0.1%、1%、2%）、乙腈-冰乙酸水溶液（其中冰乙酸的體積分數分別為0.1%、1%、2%）。試驗結果表明采用甲醇-水體系作為流動相時，色譜峰有拖尾，峰形不對稱；采用乙腈-水體系色譜峰尖銳，峰面積大，峰寬較窄。乙腈-乙酸水溶液與乙腈-水的洗脫效果相當，故選擇乙腈-水作為本實驗的流動相。

實驗中比較了不同梯度洗脫程序，分析結果表明：采用梯度洗脫可以使被測組分得到完全分離，梯度不變改變洗脫的流速發現，流速越大，保留時間越短，峰面積越小，峰高越低；流速越小，保留時間越長，峰面積越大，色譜峰越寬。試驗中優化了淋洗液的流速，選擇1.3中的梯度洗脫條件，當淋洗液的流速為0.20 mL／min時，歐前胡素的色譜峰尖銳且對稱。

（2）檢測波長的選擇

由于歐前胡素的結構特征使其在252 nm和330 nm波長附近都有紫外吸收。因此，為選擇適合歐前胡素的檢測波長，分別在 242、246、248、250、254、256、258、260、320、324、326、330 nm 波 長 下 對標準樣品進行掃描。分析結果顯示，在248 nm波長下歐前胡素的峰形尖銳，有最大峰面積，故選擇檢測波長為248 nm。

2.2 萃取條件的優化

準確稱取一煙用香精樣品0.50 g（ 精確至0.000 1 g），分別采用10 mL的甲醇、乙腈，體積比為1∶1的甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-2%冰乙酸水溶液、乙腈-2%冰乙酸水溶液對該樣品進行超聲萃取，將萃取液分別經0.22 μm水系和有機系濾膜過濾后移入2 mL樣品瓶，進行超高效液相色譜分析，結果見表1。結果表明：體積比為1∶1的乙腈水溶液萃取后樣品的色譜峰面積最大，色譜峰的峰型尖銳且分離完全，因此實驗選取體積比為1∶1的乙腈-水溶液為萃取劑。

表1 不同萃取溶劑的分析結果

準確稱取一煙用香精樣品0.50 g（ 精確至0.000 1 g），加入10 mL體積比為1∶1的乙腈水溶液，分別超聲萃取 10、20、30、40、50、60 min，將萃取液經0.22 μm有機系濾膜過濾后移入2 mL樣品瓶，進行超高效液相色譜分析，結果見表2。結果表明：隨著萃取時間的不斷增加，色譜峰面積先增加后緩慢減小，超聲萃取40 min時色譜峰面積最大，因此選擇萃取時間為40 min。

表2 不同萃取時間的分析結果

2.3 線性方程

將歐前胡素標準儲備液逐級稀釋為0.16、0.80、1.60、4.00、8.00 μg／mL 的系列標準工作溶液，按 1.3色譜條件對系列標準工作溶液進行測定，以峰面積y為縱坐標，歐前胡素濃度x為橫坐標進行線性回歸，得到線性方程及相關系數見表3。

移取0.16 μg／mL的標準溶液2 mL于進樣瓶中，平行測定11次，以3倍空白的標準偏差對應值作為方法的檢出限，結果見表3。

表3 歐前胡素的線性范圍、線性方程和檢出限

2.4 精密度及穩定性

準確稱取1號、10號、11號煙用香精樣品0.50 g（精確至0.000 1 g），平行稱取6份，按1.2處理樣品，在1.3色譜分析條件下進行分析，結果見表4。由表4可知，1 d內重復進樣6次，3種煙用香精樣品中歐前胡素測定結果的相對標準偏差分別為0.80%、0.68%、1.36%，說明該分析方法具有較好的重現性；3 d內重復進樣6次，歐前胡素測定結果的相對標準偏差分別為2.81%、1.84%、2.97%，說明該方法處理樣品中的歐前胡素具有較好的穩定性。

表4 歐前胡素分析方法的精密度及穩定性

2.5 回收試驗

在1號和10號煙用香精樣品中分別加入高、中、低3個不同量的標準樣品。準確稱取添加標樣后的1號和10號樣品0.50 g（精確至0.000 1 g），平行稱取3份，在1.3色譜分析條件下進行分析，由本底值、加入量和測定值經計算可得到歐前胡素的回收率，結果見表5。由表5可知，歐前胡素的回收率在90.83%～97.85%之間。

表5 歐前胡素的回收試驗結果

2.6 實際樣品的測定

準確稱取20種煙用香精樣品0.50 g（ 精確至0.0001 g）分別按1.2處理樣品，在1.3色譜分析條件下進行測定，每個樣品平行測定兩份，結果見表6。由表6可知，被測的20種煙用香精樣品中大部分不含有歐前胡素，4種被測香精中含有歐前胡素，含量在 3.08～24.96 μg／g之間。

表6 20種煙用香精樣品測定結果

3 結論

建立了測定煙用香精中歐前胡素的超高效液相色譜法。對20種不同類型的煙用香精進行了檢測，結果表明：被測定的20種煙用香精樣品中大部分不含有歐前胡素，4種被測香精中含有歐前胡素，含量在3.08～24.96 μg／g之間。該方法簡便快速，穩定可靠，重復性好。

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DETERMINATION OF IMPERATORIN IN TOBACCO FLAVOR BY RP-UPLC

Wang Xueying1，2，Lu Sheming1，Zhu Li1，Meng Zhaoyu1，Cao Qiue2
［1.R&D Center of Hongta Tobacco(Group) Co. Ltd.，Yuxi 653100，China；2.College of Chemical Science and Engineering，Yunnan University，Kunming 650091，China］

A method for determination of imperatorin in tobacco flavor by reversed phase ultra performance liquid chromatography was established. 20 kinds of tobacco flavor samples were extracted by acetonitrile-water (volume ratio of 1∶1),separated at 30℃ on ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm) column and eluted with acetonitrile-water as the mobile phase. Flow rate was 0.2 mL／min and the detection wavelength was 248 nm.The detection limit of imperatorin was 0.039 5 μg／g. The content of imperatorin was linear with the peak area in the range of 0.16-8.00 mg／L(r=0.999 9). The RSD of imperatorin determination results was 0.68%-2.97%, and the average recoveries of imperatorin ranged from 90.83 % to 97.85 %.

UPLC， tobacco flavor， imperatorin

陸舍銘，lushe@ustc.edu

2011-08-26