Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統在BHK細胞表達鼠IL-2蛋白的研究*

黃大林 戴支凱 王 鑫 李彬彬 鐘 江

Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統在BHK細胞表達鼠IL-2蛋白的研究*

黃大林 戴支凱 王 鑫 李彬彬 鐘 江△

目的：利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統在BHK細胞表達重組鼠白細胞介素（IL）-2蛋白。方法：用Flag標記鼠IL-2并加入真核細胞啟動子CMV，構建重組質粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鑒定；將鼠IL-2克隆入桿狀病毒表達載體pFastBacDual中，將pFB-CMV-IL-2轉化到含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的DH10Bac感受態菌中，篩選陽性克隆，獲得重組桿狀病毒載體Bacmid-pFB-CMV-IL-2，抽提質粒；用脂質體轉染法將Bacmid-pFB-CMV-IL-2轉染Sf9昆蟲細胞包裝病毒，收獲重組桿狀病毒，將構建病毒轉導BHK細胞培養，用Western blot檢測IL-2蛋白。結果：通過桿狀病毒表達系統，在BHK細胞成功表達重組的鼠IL-2蛋白。結論：重組桿狀病毒在真核細胞中成功表達重組鼠IL-2蛋白。

白細胞介素2 重組蛋白質類 桿狀病毒科 遺傳載體 質粒 聚合酶鏈反應 小鼠,近交系

20世紀90年代出現的Bac-to-Bac商業化系統，成功地將桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統變為具有廣泛用途的系統，通過這個系統將外源基因定向重組克隆到桿狀病毒基因組上多角體啟動子后，成功構建桿狀病毒的穿梭質粒。提取穿梭質粒，即病毒基因組提取出來，轉染昆蟲細胞就可以得到重組病毒。隨著Bac-to-Bac應用范圍越來越廣，現在已經發展出一系列用于定向轉座的供體質粒，甚至能利用桿狀病毒在昆蟲細胞中同時表達多個蛋白。迄今已經成功表達了許多外源基因，例如雞胃酶解肌球蛋白[1]、視紫質激酶[2]、人類干擾素-β[3]等。筆者使用Bac-to-Bac系統構建鼠白細胞介素-2（IL-2）基因桿狀病毒表達載體并在哺乳動物細胞表達重組構建鼠IL-2蛋白，報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒 大腸桿菌JF1125；昆蟲細胞草地夜蛾（Spodoptera frugierda）卵巢組織細胞系Sf9，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）；pFastBacDual質粒，pFastTATBacDu?al質粒及T-CMVp，幼倉鼠腎細胞（BHK）等由復旦大學微生物學與微生物工程系鐘江課題組實驗室保存提供。

1.2 試劑與儀器 限制性內切酶、T4 DNA連接酶和堿性磷酸酶購自TaKaRa大連寶生物工程公司；TNM-FH培養液由購自Sigma公司的粉劑配制，加10%的小牛血清使用。轉染試劑CellFectin購自Invitrogen公司；RMPI 1640培養液購自杭州吉諾公司；DNA凝膠回收試劑盒以及PCR產物回收試劑盒購自上海杰瑞生物科技有限公司；細胞總RNA抽提試劑盒和反轉錄試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司。λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ購自MBI Fermentas公司，DL2000購自物TaKaRa公司，RNase A購自上海華舜生物工程有限公司；預染蛋白Marker（mid）購自北京鼎國昌盛生物公司；Taq DNA polymerase購自北京天根公司；蛋白酶K購自Roche公司；F-7425 Anti-Flag和羊抗兔IgG抗體購自Sigma公司。GNP-9080型隔水式恒溫培養箱；HZ-9211K恒溫細菌培養搖床；81-2型恒溫磁力攪拌器，DK-8D型電熱恒溫水槽；無菌操作臺；Eppendorf臺式高速離心機（Centrifige 5415D）；PCR儀（Thermo Life Science）；YLN-2000 DNA 凝膠成像儀；DYY-2C型DNA電泳儀；BIO-RAD POWER PAC3000蛋白電泳儀；Nikon倒置顯微鏡（FX35A）；SHP-150型生化培養箱，Thermo Scientific Series CO2培養箱。

1.3 方法

1.3.1 小鼠IL-2基因的獲得及鑒定 采用SPF級40日齡的昆明小鼠購自復旦大學上海醫學院實驗動物科學部，平均體質量為(22.08±3.00)g。拉頸處死小鼠，打開腹腔，無菌取出小鼠脾臟，使用100目細胞篩網制備脾細胞懸液，采用淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞。將鼠脾淋巴細胞在刀豆球蛋白A（Con A）的刺激下體外培養72 h后，提取激活淋巴細胞總RNA；參照GenBank鼠IL-2 cDNA基因序列設計一對引物，逆轉錄得到cDNA，以此為模板進行PCR擴增。IL-2引物上游-ATATCTAGAATACAGCAGCATGCAGCTCGC-，下游-TCTGCTACCTTAGTCGTCGTGGTCTTTGTAGTCTTGAGG GCTTTTGAGATG-，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30個循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。

1.3.2 重組含有小鼠IL-2基因質粒載體 用XbaⅠ/KpnⅠ雙酶分別酶切pFastBac Dual質粒和IL-2的PCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收DNA，分別作為載體和供體片段，通過T4連接酶連接得到pFB-IL-2，經過轉化大腸桿菌JF1125得到pFB-IL2質粒，提取質粒進行酶切和PCR鑒定。

1.3.3 載體加入真核細胞啟動子CMV 用EcoRⅠ酶切pFB-IL-2（需CIAP去磷酸化處理）和T-CMVp上切下CMV啟動子片段，分別作為載體和供體片段，通過T4連接酶在16℃連接12 h,將CMV啟動子插入pFB-IL-2的EcoRⅠ位點，經過轉化大腸桿菌JF1125得到pFB-CMV-IL-2質粒，提取質粒DNA。

1.3.4 重組小鼠IL-2基因質粒載體的酶切鑒定和序列分析驗證 pFB-CMV-IL-2質粒用KpnⅠ、XbaⅠ和BglⅡ分別進行酶切鑒定，結果正確后將構建的pFB-CMV-IL-2質粒轉化JF1125，將菌液進行質粒序列分析測定（上海博尚生物公司）。

1.3.5 重組Bacmid-pFB-CMV-IL-2質粒轉染Sf9細胞 利用Invitrogen公司的產品Bac-to-Bac系統來構建重組桿狀病毒，挑取轉化DH10Bac感受態細胞生長的白色菌落，提取Bacmid，脂質體轉染法將Bacmid-pFB-CMV-IL-2轉染Sf9細胞包裝病毒，Sf9細胞培養于FH10培養液中培養3 d，離心后收獲上清，即獲取完整重組桿狀病毒，反復感染Sf9細胞擴增病毒。提取病毒基因組，用PCR驗證重組桿狀病毒的正確性。

1.3.6 重組桿狀病毒轉導BHK細胞 將24孔板中每孔接種大約1.5×105個BHK細胞，培養細胞過夜，貼壁后加入適量病毒液使感染復數（MOI）約為5 pfu/cell，37℃ CO2培養箱培養，病毒感染72 h后收獲細胞。

1.3.7 SDS-PAGE電泳和Western blot檢測重組的IL-2蛋白 用胰酶消化BHK細胞后，將細胞吹打下來，5 000 r/min離心5 min。棄上清，加入50 μL 2×SDS 樣品緩沖液，100 ℃煮沸5 min。樣品進行10%SDS-PAGE電泳，使用預染蛋白Marker，電泳后將PAGE膠剝離，放入NC膜轉移裝置中進行電轉移，將電泳槽置于裝滿冰塊盆中，恒流200 mA，電泳2 h；電轉移結束后，取出轉移NC膜，一抗用兔源F-7425 An?ti-Flag克隆抗體，二抗為羊抗兔IgG抗體，在10 mL AP底物緩沖液中加入BCIP 33 μL、NBT 66 μL，將NC膜放入，進行顯色反應，直到出現清晰的條帶，膜干燥后，拍照后用塑料袋封存。

2 結果

2.1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果 擴增產物片段大小為600 bp，與陽性對照IL-2吻合，見圖1。

2.2 PCR鑒定pFB-IL-2質粒結果 擴增產物片段大小為600 bp，與陽性對照IL-2吻合，見圖2。

2.3 酶切pFB-CMV-IL-2質粒結果 用KpnⅠ酶切PFB-CMV-IL-2分別得到0.5、0.7和4.7 kb共3個片段；用XbaⅠ酶切得到0.7和5.2 kb片段；用BglⅡ酶切得到0.5、1.8和3.6 kb共3個片段，與預期結果吻合，見圖3。

2.4 測序結果 將菌液測序結果在NCBI進行檢索，利用Blast軟件在GenBank進行序列比對，與GenBank鼠IL-2相吻合，成功構建含鼠IL-2的載體質粒，測序驗證實驗結果正確。

2.5 重組桿狀病毒穿梭載體的PCR驗證 提取病毒DNA基因組，用IL-2特異性引物進行PCR擴增,成功擴出了1條約600 bp的條帶，與預期結果相符，見圖4。

2.6 Western blot結果分析 在50 ku之間有一條帶,表明重組桿狀病毒感染的BHK細胞表達了與抗單克隆抗體特異性結合的蛋白,即IL-2，見圖5。

3 討論

與其他病毒載體系統相比較，重組桿狀病毒構建方便，而且易于擴大培養規模及得到高滴度的病毒；桿狀病毒的基因組和棒狀的核衣殼可以容納100多kb的DNA，最大可插入約40 kb的外源基因；能轉染末端分化細胞和原代培養細胞；以高感染復數感染哺乳動物細胞時也沒有細胞毒性；安全性好，在哺乳動物細胞內不會整合到基因組中，不能復制，自身啟動子在哺乳動物細胞內也沒有活性。以上優點使得桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統具有廣泛應用性。自1983年Smith[3]首次利用AcNPV表達成功人干擾素-β以來，現估計有近千種外源基因在桿狀病毒表達載體中得到表達。桿狀病毒可以作為一種新型的基因表達載體將外源基因導入哺乳動物細胞內進行表達，因此，重組桿狀病毒已被廣泛應用于基因工程[4]、疫苗開發[5]、基因治療[6]等眾多領域中。

IL-2是主要由激活T淋巴細胞產生的一類Th1型細胞因子，它能夠有效地提高機體的免疫功能，促進T、B淋巴細胞的增殖，增強NK細胞、單核巨噬細胞等的殺傷活性；能激活和提高免疫細胞的多種功能，提高其殺傷癌細胞、病毒或細菌感染細胞、促進抗體生成和分泌的能力，在抗腫瘤、抗毒素、免疫調節及治療感染性疾病中具有重要作用[7]。自Taniguchi等[8]從人體細胞中首次克隆出IL-2全長cDNA并報道其全序列以來，已從30多種動物中克隆出此基因，重組IL-2還在提高機體免疫力、抗感染和癌癥治療等方面獲得了廣泛的應用[9]。

本研究通過RT-PCR擴增出鼠IL-2基因，用Flag對IL-2進行標記，通過構建鼠IL-2的轉移質粒，通過克隆將其插入pFastBacDual和pFastBacDu?alTAT，成功構建了桿狀病毒表達系統的轉移載體pFB-CMV-IL2質粒，通過轉染Sf9昆蟲細胞，獲得含IL-2的重組桿狀病毒，通過轉導BHK細胞成功表達IL-2蛋白，為進一步研究該重組蛋白的生物學活性、動物實驗等奠定了良好的基礎，亦為其他蛋白質的真核表達提供了方法學的參考。

致謝：感謝復旦大學微生物系鐘江教授提供資助。

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[2]Cha K,Bruel C,Inglese J,et al.Rhodopsin kinase Expression in bac?ulovirus-infected insect cells,and characterization of post-transla?tional modifications[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997,94（5）:10577-10582.

[3]Smith MD.Production of human beta interferon in insect cell infect?ed with baculovirus express vectors[J].Mol Cell Biol，1983,3（2）:2156-2165.

[4]Ames RS,Formwald JA,Nuthulaganti P,et al.BacMam recombinant baculoviruses in G protein-coupled receptor drug discovery[J].Re?ceptors Channels,2004,10（3）:99-107.

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[8]Taniguchi T,Matsui H,Fujita T,et al.Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2[J].Nature,1983,302（5906）:305-310.

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Bac-to-Bac Baculovirus Expression System in IL-2 Protein of BHK

HUANG Dalin,DAI Zhikai,WANG Xin,LI Binbin,ZHONG Jiang

Guilin Medical University,Guangxi 541004,China

Objective：To construct recombinant mouse IL-2 protein in BHK cells using Bac-to-Bac baculovirus expres?sion system.Methods：The mouse IL-2 was marked by Flag，and joined the eukaryotic cell promoter CMV.The plasmid pFB-CMV-IL-2 was constructed to recombinant,restriction enzyme was used to digest,and was amplified by PCR.The mouse IL-2 was cloned into the baculovirus expression vector pFastBacDual and pFB-CMV-IL-2 was transformed into bacu?lovirus shuttle vector containing the DH10Bac competent bacmid bacteria.The clones were recombinant baculovirus vector Bacmid-pFB-CMV-IL-2,extracted plasmid with liposome transfection method Bacmid-pFB-CMV-IL-2 transfected Sf9 in?sect cells packaging the virus,harvested recombinant baculovirus.A virus transduction of BHK cell culture was built using Western blot to detect the IL-2 protein.Results:By baculovirus expression system,mouse recombinant IL-2 protein was successfully expressed in BHK cells.Conclusion:Recombinant baculovirus was successfully expressed mouse IL-2 protein in eukaryotic cells.

interleukin-2 recombinant proteins baculoviridae genetic vectors plasmids polymerase chain re?action mice,inbred strains

*國家科技攻關863資助項目（項目編號:2007AA02Z125）

541004 廣西，桂林醫學院微生物學與免疫學教研室（黃大林，戴支凱）；復旦大學生命科學學院微生物學與微生物工程系（王鑫，李彬彬，鐘江）

△通訊作者 E-mail:jzhong@fudan.edu.cn

（2010-09-08收稿 2010-11-29修回）

（本文編輯 魏杰）