腦乳酸在運動性疲勞過程中作用機制的動態研究

楊東升，劉曉莉，喬德才

●成果報告Original Articles

腦乳酸在運動性疲勞過程中作用機制的動態研究

楊東升1，2，劉曉莉2，喬德才2

目的：研究腦乳酸在運動性疲勞發生過程中的作用機制。方法：采用微透析活體檢測技術，觀察力竭運動過程中大鼠紋狀體乳酸濃度的動態變化，通過腦室注射乳酸阻斷劑（4-CIN），觀察腦內乳酸干預對大鼠運動耐力及皮層腦電（ECoG）的影響。結果：大鼠紋狀體胞外乳酸濃度在運動初期顯著升高（P＜0.05），在運動后期直至疲勞后的恢復期均顯著低于安靜時水平（P＜0.05，P＜0.01）；運動過程中，大鼠4-CIN腦室注射后20 min皮層腦電功率譜總功率迅速下降，顯著低于人工腦脊液（aCSF）對照組（P＜0.05），腦乳酸阻斷組大鼠運動至力竭平均時間顯著低于對照組（P＜0.01）。結論：腦乳酸在運動性疲勞的發生過程中發揮著重要作用，腦乳酸代謝不足可能是導致運動性疲勞出現，機體運動能力降低的主要原因之一。

乳酸；腦；大鼠；皮層腦電；運動疲勞

Pellerin等1994年提出的“星形膠質細胞－神經元乳酸穿梭”假說為腦乳酸賦予了新的代謝角色，乳酸不再是腦內能量代謝的“廢物”和缺血缺氧的“毒物”，而是能量代謝不可或缺的代謝底物[1]。進一步的研究證明，腦內神經元還具有優先利用乳酸作為其能量代謝底物的特性[2]。有研究發現，運動過程中，腦對于葡萄糖的攝取會隨著運動強度的增加而減少，同時，腦利用乳酸作為其能量代謝底物以維持運動所需的神經元的活動[3]。神經系統不能產生和維持足夠的神經沖動到達所支配的運動肌是導致運動性疲勞的主要原因[4]。腦內能量代謝是神經系統電生理活動的物質基礎，腦乳酸在維持神經元的活性方面均起著非常重要的作用[5-6]。因此，機體運動過程中腦乳酸的代謝平衡是保證中樞神經系統持續向外周發放神經沖動、維持運動能力的關鍵因素。

長期以來，受傳統研究手段和方法的局限，對于運動過程中腦乳酸的研究無法實現，現有相關的少量報道也多是對于運動疲勞后機制的探討，無法解釋乳酸在運動疲勞形成過程中的作用。因此，本文采用微透析與電化學檢測聯用的技術對大鼠在一次力竭運動過程中及力竭后恢復期腦乳酸的代謝變化進行在線觀察。乳酸阻斷劑（alpha-cyano-4-hydroxycinnamate，4-CIN）可以有效的阻止神經元對乳酸的攝取和利用[7]，因此本文同時采用腦室微量注射乳酸阻斷劑的研究方法，觀察腦乳酸干預對大鼠運動耐力及其皮層腦電（electrocorticogram，ECoG）的影響，為進一步揭示腦乳酸代謝與運動性疲勞的關系提供實驗依據。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象

健康雄性Wistar大鼠隨機分為腦乳酸測定組、4-CIN干預組和對照組，實驗動物購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2005-0002，體重（250±10）g，常規分籠飼養，室內溫度（20±3）℃，相對濕度40%～60%，自然光照。

1.2 實驗儀器及試劑

BAS微透析系統，三維腦立體定位儀，乳酸在線電化學分析系統，動物跑臺，多導電信號采集處理系統，皮層電極及導聯裝置（自制）；戊巴比妥鈉（Fluka），alpha-cyano-4-hydroxycinnamate（sigma）。人工腦脊液（Artificial cerebrospinal fluid，aCSF）各組份濃度（mmol/L）分別為：NaCl 126，KCl 2．4，KH2PO40．5，MgCl20．85，NaHCO327．5，Na2SO40．5，CaCl21．1，pH值為7．4，無菌（0．2uM）過濾，冷藏備用。

1.3 大鼠微透析探針套管的植入手術

腦乳酸測定組大鼠以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉，固定于腦立體定位儀上，分離頭頂皮膚，按照大鼠腦立體定位圖譜[8]，紋狀體對應部位鉆孔，掀去硬腦膜，將微透析套管定位于左側紋狀體內（P：0．2，L：3，H：3．2），小螺釘、牙科水泥固定。術后恢復4到5天，待大鼠恢復正常的行動與飲食，無萎靡不振等不良術后反應，開始恢復性的漸增負荷跑臺運動訓練。

1.4 大鼠腦室注射管、ECoG電極的植入手術

乳酸干預組和對照組大鼠麻醉固定后，在側腦室對應的顱骨部位鉆孔（P：0．9 mm，R：1．5mm，H：3．5mm），掀去硬腦膜，植入微量注射導管。在腦皮層上下肢運動區對應的顱骨部位鉆孔，將皮層記錄電極植入腦皮層表面（P：1．8mm，R：2 mm，H：0．5 mm），小腦上方（P：10．0 mm，R：0 mm，H：0．5 mm）放置參考電極，牙科水泥固定，術后處理同乳酸測定組。

1.5 大鼠力竭運動方案

當術后大鼠能夠以20m/min的速度跑30min后，即可進行正式實驗。運動方案參照Bedford運動方案[9]稍作調整：運動負荷分為三級：I級負荷：10 m/min，15 m in；II級負荷：15 m/min 15min；III級負荷：20m/m in，至力竭。在實驗過程中觀察大鼠的運動行為特征，判斷動物的疲勞狀態。大鼠力竭標準為大鼠跑姿由蹬地跑變為伏地跑，長期滯留于跑道末端，聲、光刺激均不能使其繼續跑動。

1.6 力竭運動過程中及恢復期大鼠腦乳酸的實時監測

將微透析探針插入腦乳酸測定組大鼠的探針套管內，探針連接灌流系統，人工腦脊液灌流，速度為1μL/min，灌流平衡時間為60min，然后將透析液與電化學檢測系統連接，開始大鼠在一次性力竭運動過程及恢復期腦乳酸的動態在線監測。電化學檢測采用林雨清等人所建立的方法[10]，采樣頻率為2次/s。以每只大鼠安靜狀態透析液的平均濃度為基礎值，每5min作為一個監測點，用各觀察點透析液乳酸濃度所占基礎值的百分比反映其變化規律。

1.7 大鼠運動過程中4-CIN腦室注射及ECoG的同步記錄

在乳酸干預組和對照大鼠開始運動以前，將微量注射泵與腦室埋藏注射導管連接，大鼠皮層記錄電極及參考電極與多導電生理儀導聯，運行RM6240多導電信號采集軟件，采樣頻率為2 k/s，50 Hz陷波記錄大鼠整個實驗過程中的ECoG，待運動結束后對其恢復期連續記錄50min，并保證整個恢復期大鼠處于清醒狀態，避免大鼠進入睡眠狀態后的ECoG影響實驗結果。4-CIN溶于人工腦脊液（10mmol/L）。乳酸干預組大鼠運動開始后30min開始向腦室內注射4-CIN溶液（0．5 ul/min），持續注射30min。對照組施以相同量的人工腦脊液（aCSF）。因為大鼠的運動能力個體差異較大，為了直觀的比較4-CIN對大鼠ECoG功率譜的影響，我們選取大鼠在安靜狀態、運動開始后60min時間內、力竭即刻和恢復期的50m in內進行了對比分析。同時，為了更直接反映ECoG功率譜總功率在運動過程中及藥物注射前后的變化情況，我們采用不同狀態時間點的總功率占安靜時的總功率的百分比來進行統計分析。

1.8 腦的組織學鑒定

所有實驗結束后，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉（0．35mL/kg），4%福爾馬林溶液常規灌流固定，腦組織冠狀面做切片，對照大鼠腦圖譜鑒定微透析探針與腦室注射管腦內位置，探針與注射管植入位置不準確的動物實驗數據不予采用。

1.9 數據統計

2 結果

2.1 力竭運動過程中及恢復期大鼠腦乳酸的實時變化

因不同大鼠運動至力竭的時間個體差異較大，為了便于觀察大鼠在力竭運動過程中紋狀體胞外乳酸濃度的變化，將整個運動過程劃分為4個階段：安靜期（0～30 min）；運動Ⅰ（30min～60min）；運動Ⅱ（力竭前60min～力竭）和恢復期（力竭～恢復90min）。從圖1中可以看出大鼠腦內紋狀體胞外乳酸在運動開始后15～20 min出現一個短暫的顯著升高（P＜0．05），而在運動后期大鼠力竭前10min紋狀體胞外乳酸濃度顯著降低（P＜0．05，P＜0．01），甚至在恢復期的90 min時間內，紋狀體胞外乳酸仍顯著低于安靜時水平（P＜0．05，P＜0．01）。

2.2 力竭運動過程中4-CIN腦室注射對大鼠ECoG功率譜總功率的影響

從表1中可以看出，aCSF對照組與乳酸干預組大鼠的ECoG功率譜總功率在藥物干預前的安靜狀態（0～20min）和運動狀態兩組大鼠的ECoG功率譜總功率組間均無顯著性差異（P＞0．05）。在運動開始后30min對照組大鼠腦室注射aCSF沒有對其ECoG產生明顯的影響，大鼠力竭運動停止后，ECoG總功率即恢復至安靜時的水平。而乳酸干預組大鼠在藥物注射后ECoG功率譜總功率即快速下降，在注射藥物后20min點、30 min點ECoG功率譜總功率顯著低于aCSF對照組（P＜0．05），恢復期10m in點4-CIN注射組大鼠ECoG功率譜總功率顯著低于aCSF對照組（P＜0．05）。

表1 4-CIN對大鼠ECoG功率譜總功率的影響（n=6）Tab.1 Influence of4-CIN on the ECoG power spectrum total power of rats

2.3 4-CIN腦室注射對大鼠運動能力的影響

從圖2中可以看出對照組大鼠的運動至力竭平均時間為（145．83±34．99）min，而4-CIN腦室注射組的運動至力竭平均時間為（81±19．09）min，顯著低于aCSF對照組大鼠的運動能力（P＜0．01）。

3 分析與討論

疲勞的“耗竭學說”認為，疲勞的出現是由于骨骼肌系統能量物質耗竭所致，而近年的研究發現機體的疲勞與中樞能量代謝也有密切的關系[3，11]。葡萄糖一直被認為是腦的主要能源物質，腦乳酸在腦的代謝過程中沒有作用。但近年的研究發現，腦除了利用葡萄糖作為能源物質外，還可以依賴乳酸來供給能量，乳酸在星形膠質細胞和神經元的能量信息傳遞和腦功能活動的能量代謝偶聯中發揮著極其重要的作用。隨即，運動與腦乳酸代謝即成為運動生理學領域關注的熱點問題[3，12-21]。然而，由于研究方法以及實驗對象的差異造成研究者們對于運動疲勞與腦乳酸代謝的研究所得出的結果卻存在著較大差異，既有乳酸堆積的報道[15]，也有乳酸沒有產生顯著變化的實驗證明[13]。本研究在清醒動物運動過程中的觀察結果發現大鼠在一次性的力竭運動過程中，腦內乳酸只在運動初期有短暫的升高，在運動后期、力竭即刻及恢復期都顯著降低。在運動的開始階段神經元興奮，功能活動顯著增強，激活星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭產生大量乳酸可能是導致胞外乳酸濃度短暫升高的主要原因。腦雖然可以從外周血液中攝取葡萄糖、乳酸為神經元提供能量，然而由于運動強度較大，持續時間長，腦的能量需求遠遠超出其從外周血液中所能攝取的能量物質的量，中樞神經系統即可能啟動糖原儲備系統將糖原酵解為乳酸來滿足神經元的能量需求[22]，最終由于糖原的耗竭導致胞外乳酸水平顯著降低。本研究結果中大鼠在運動停止后的90 min內，腦內乳酸仍保持較低的水平原因可能就是在運動停止后，其原因可能是腦雖然可以從外周血液中攝取大量的葡萄糖和乳酸，但此時這些被腦所攝取的碳水化合物被用于腦糖原的合成儲備，所以在短時間內腦乳酸仍不能恢復至運動前的水平[23]。

腦內乳酸的穿梭是通過單羧酸轉運體（monocarboxylate transporters，MCT）來完成的，4-CIN有效地抑制神經元的MCT對于腦內乳酸的轉運，阻止神經元對乳酸的攝取和利用[6]。為了進一步證實腦乳酸在運動性疲勞過程中的作用，本文采用4-CIN在運動過程中腦室注射的方法阻斷腦神經元對于乳酸的攝取和利用，觀察腦內乳酸阻斷對大鼠運動能力的影響。ECoG功率值反應皮層神經元信號能量的大小，間接反映中樞神經系統神經元電生理活動的活性，ECoG功率值增高說明其神經元的功能增強，反之則說明神經元的功能減弱。本實驗結果中大鼠在開始運動時ECoG功率值均顯著升高，說明了在運動狀態下，大鼠皮層神經元的功能活動顯著增強以維持軀體的運動。然而，當大鼠在運動過程中腦室注射4-CIN 20min后其功率值顯著降低，提示運動過程中當乳酸在腦內的代謝受阻，乳酸不能有效地為神經元提供能量的時候，運動過程大腦皮層的電活動即顯著減弱。本文采用方差分析的方法統計結果發現不同大鼠ECoG功率值在運動過程中個體差異較大，而在運動前后的安靜狀態則較小。分析其原因可能是因為不同動物的運動能力及皮層運動區的神經元活性的差異較大，完成相同強度運動需要的皮層神經元元的電活動功率差異較大所造成的。

實驗結果提示腦乳酸對于運動過程中維持中樞神經系統高水平的電生理功能活動起著極其重要的作用。本實驗對大鼠運動能力的觀察結果也發現4-CIN腦室注射可以顯著降低大鼠的運動能力，其原因可能是4-CIN進入腦組織后阻斷了神經元對于乳酸的攝取和利用所致。雖然運動過程中腦內葡萄糖以及腦內糖原儲備也可為神經神經細胞提供能量，但在運動狀態下，腦神經元所主要依賴的能量底物是乳酸[3]，4-CIN導致腦內外源性和內源性的乳酸均不能參與能量代謝，直接影響到神經元其正常的電生理活動，表現為腦電功率下降、運動能力下降。因此，本實驗結果再次證實乳酸在運動過程中腦的能量代謝過程中發揮著不可替代的作用，而且大鼠運動過程中腦內乳酸水平的降低是導致運動性疲勞出現、機體運動能力降低的主要原因之一。

4 結論

腦乳酸在運動性疲勞的發生過程中發揮著重要的作用，腦內乳酸代謝不足可能是導致運動性疲勞出現，機體運動能力降低的主要原因之一。

[1]Pellerin L，Magistretti P J.Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis：a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization[J].Proc Natl Acad SciU SA，1994，91（22）：10 625-10629.

[2]Bouzier-Sore A K，Voisin P，Canioni P，et al.Lactate is a preferential oxidativeenergy substrate overglucose forneurons in culture[J].JCereb Blood Flow Metab，2003，23（11）：1 298-1 306.

[3]Kemppainen J，Aalto S，Fujimoto T，et al.High intensity exercise decreases global brain glucose uptake in humans[J].J Physiol，2005，568（Pt1）：323-332.

[4]Davis JM，Bailey S P.Possible mechanisms of central nervous system fatigue duringexercise[J].Med Sci Sports Exerc，1997，29（1）：45-57.

[5]Schurr A，West CA，Rigor BM.Lactate-supported synaptic function in the rathippocampalslice preparation[J].Science，1988，240（4 857）：1 326-1 328.

[6]袁建琴，李方暉，付德榮，等.乳酸的最新研究進展[J].西安體育學院學報，2009（2）：76-79.

[7]Schurr A，Payne R S，Miller J J，et al.Brain lactate is an obligatory aerobic energy substrate for functional recovery after hypoxia：further in vitrovalidation[J].JNeurochem，1997，69（1）：423-426.

[8]Paxinos G，Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates[M].2nd Edition ed.San Diego：Academic press，1997：22.

[9]Bedford T，Tipton C，Wilson N.Maximum oxygen consumption of ratsand its changeswith various experimental procedures[J].Journal of Applied Physiology，1979，47（6）：1 278-1 283.

[10]Lin Y，Zhu N，Yu P，et al.Physiologically relevant online electrochemicalmethod for continuous and simultaneousmonitoring of striatum glucose and lactate following global cerebral ischemia/reperfusion[J].Anal Chem，2009，81（6）：2 067-2 074.

[11]Brown A M，Tekkok S B，Ransom B R.Glycogen regulation and functional role inmousewhitematter[J].JPhysiol，2003，549（Pt2）：501-512.

[12]Nybo L，Moller K，Pedersen B K，etal.Association between fatigue and failure to preserve cerebralenergy turnover during prolonged exercise[J].Acta Physiol Scand，2003，179（1）：67-74.

[13]Dalsgaard M K，Volianitis S，Yoshiga CC，et al.Cerebralmetabolism duringupperand lowerbodyexercise[J].JAppl Physiol，2004，97（5）：1 733-1 739.

[14]Dalsgaard M K，Quistorff B，Danielsen E R，et al.A reduced cerebral metabolic ratio in exercise reflectsmetabolism and not accumulation of lactate within the human brain[J].J Physiol，2004，554（Pt 2）：571-578.

[15]王靜，劉洪濤，馬強，等.運動性中樞疲勞及乳酸對大鼠大腦皮質神經細胞MCTmRNA表達的影響[J].中國運動醫學雜志，2007，26（01）：52-55.

[16]王靜，劉洪濤，馬強，等.運動性中樞疲勞時大鼠腦乳酸和糖原含量的變化[J].中國運動醫學雜志，2005，24（2）：152-156.

[17]De Bruin LA，Schasfoort EM，Steffens A B，et al.Effects of stress and exerciseon rathippocampus and striatum extracellular lactate[J].Am J Physiol，1990，259（4Pt2）：R773-R779.

[18]Korf J.Intracerebral trafficking of lactate in vivo duringstress，exercise，electroconvulsive shock and ischemia as studied with microdialysis[J].Dev Neurosci，1996，18（5-6）：405-414.

[19]Secher N H，Quistorff B.Brain glucose and lactate uptake during exhaustiveexercise[J].JPhysiol，2005，568（Pt1）：3.

[20]喬德才，吳迪，侯莉娟，等.運動疲勞對大鼠黑質致密區DA能神經元電活動的影響[J].上海體育學院學報，2010（1）：46-48.

[21]張宗國.極量強度運動后血乳酸產生機制的質疑與新認識[J].山東體育學院學報，2011（7）：47-51.

[22]Dalsgaard M K.Fuelling cerebralactivity in exercisingman[J].JCereb Blood Flow Metab，2006，26（6）：731-750.

[23]Ide K，Schmalbruch IK，Quistorff B，et al.Lactate，glucose and O2 uptake in human brain during recovery from maximal exercise[J].J Physiol，2000，522Pt1：159-164.

Dynam ic Research of M echanism of Brain Lactate on Exercise-induced Fatigue

YANG Dongsheng1，2，LIU Xiaoli2，QIAO Decai2
（1．Institute of Sport Science Research，Zhejiang Technology University，Hangzhou 310014，China；2．School of PE and Sports，Beijing NormalUniversity，Beijing 100875，China）

Objective：The aim of this research is to study themechanism of brain lactate in the development of exercise-induced fatigue．Methods：Coupling ofmicrodialysis and electrochemical detection techniquewas used for the on-line analysis of extracellular lactate in rats'striatum during exhaustive exercise．Ventriclemicro-injectionmethod was applied to study the effect of 4-CIN on the exercise ability and electrocorticogram of rats．Results：Striatum extracellular lactate of rat significantly increased at the begging of exercise（P＜0．05）and it decreased significantly during the later exercise time and recovery time（P＜0．05，P＜0．01）；4-CIN can significantly reduce the power of electrocorticogram in the process of exercise（P＜0．05）and decrease the exercise time of rats（P＜0．01）．Conclusion：Brain lactate plays the important role in the development of exercise-induced fatigue．Lacking of lactatemay be one of the important reasonswhich caused the exercise-induced fatigue．

lactate；brain；rat；electrocorticogram；sport fatigue

G 804．7

A

1005-0000（2011）06-0485-04

2011-01-04；

2011-09-10；錄用日期：2011-09-15

國家自然科學基金項目（項目編號：30971416；31171138）

楊東升（1978-）,男，山西朔州人，博士，講師，研究方向為運動生理學。

1.浙江工業大學體育科學研究中心，浙江杭州310023；2.北京師范大學體育與運動學院，北京100875。