毛細管電泳檢測發酵液中1，3-二羥基丙酮方法的建立

宋 煒魏勝華 黃蒙蒙 湯 斌 陶玉貴

（安徽工程大學生物與化學工程學院，蕪湖 241000）

毛細管電泳檢測發酵液中1，3-二羥基丙酮方法的建立

宋 煒*魏勝華 黃蒙蒙 湯 斌 陶玉貴

（安徽工程大學生物與化學工程學院，蕪湖 241000）

建立了利用毛細管電泳（CE）技術快速、準確檢測發酵液中1，3-二羥基丙酮含量的新方法。所用熔融石英毛細管規格為50 μm×60 cm（有效長度為45 cm），分離電壓為24 kV，緩沖液為pH9.5的30 mmol/L硼砂緩沖溶液，200 nm處檢測DHA。結果表明，DHA標準樣品的遷移時間為8.3 min，在100 μg/mL～1 000 μg/mL范圍內線性關系良好（R2=0.999 5），加樣回收率為97.79%，RSD為1.81%。測得以甘油作為底物發酵產DHA發酵液中DHA含量為3.220 g/L，此方法可有效應用于產DHA發酵過程中產物的檢測。

1，3-二羥基丙酮；高效毛細管電泳；檢測

1，3-二羥基丙酮或二羥基丙酮（Dihydroxyacetone，簡寫DHA）外觀為白色粉末，具有特殊臭味，熔點為75℃～80℃（單體/二聚物的混合物），一般狀態下是二聚體（1，4-Dioxane）結晶,經溶解或加熱則變為單體，可溶于水、乙醇、乙醚中。DHA是一種天然存在的水溶性酮糖，具有生物可降解性，可食用且對人體無害。DHA作為一種重要的化工原料、醫藥中間體和功能添加劑在國外已得到廣泛的實際應用。

已報道DHA的分析方法有二苯胺顯色法、薄層色譜、紙層析、氣相色譜、高效液相色譜等方法，其中二苯胺顯色法由于操作需要顯色反應，誤差相對較大，存在一定的局限性；薄層色譜分析法所用試劑昂貴且準確定量困難；氣相色譜分析法衍生化過程復雜，需要大量的衍生化試劑；高效液相色譜所需儀器昂貴，樣品進樣量大，檢測有所不便。與HPLC相比，CE應用面廣，效率高，操作費用和環境污染低，分析一個試樣僅需幾毫升流動液，越來越受到人們青睞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀，配備二極管陣列檢測器；熔融石英毛細管，50 μm×60 cm，河北省銳灃色譜器件有限公司，有效長度45 cm；KQ-250DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；微孔濾膜為孔徑0.45 μm，上海市新亞凈化器件廠；試驗用水為雙蒸水，其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 樣品

1，3-二羥基丙酮標準品（阿拉丁），購于上海晶純試劑有限公司；待測樣品為產DHA菌種接種甘油發酵培養基，30℃，培養2 d后取發酵上清液。

1.1.3 培養基

斜面保藏培養基（按質量分數）：甘油3%，酵母膏1%，碳酸鈣0.3%；種子培養基（按質量分數）：甘油6%、酵母膏1%、碳酸鈣3%；發酵培養基（按質量分數）：甘油6%、酵母膏1%、碳酸鈣3%、磷酸二氫鉀0.1%、無水硫酸鎂0.05%。

1.2 方法

1.2.1 毛細管電泳分析條件

熔融石英毛細管（總長度60 cm，有效長度45 cm）；運行緩沖溶液：30 mmol/L硼砂緩沖溶液（加入0.1%NaOH調pH至9.5）；柱溫：25℃；進樣壓力3.45 kPa，時間5 s；紫外檢測波長：200 nm，柱上檢測。清洗程序：2次進樣之間用0.1 mol/L NaOH水溶液沖洗2 min，再用水沖洗2 min，最后用硼砂緩沖液沖洗2 min。

1.2.2 樣品處理

將實驗室篩選到的可產DHA菌種從斜面保藏培養基接種到種子培養基，30℃培養24 h，取5 mL接種至50 mL發酵培養基中，發酵48 h后取樣，4 000 r/min離心15 min，將發酵液上清液稀釋數倍后用微孔濾膜過濾，所得濾液直接進樣測定。

2 結果

2.1 毛細管電泳的條件優化

2.1.1 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器對1，3-二羥基丙酮進行全波長掃描（190 nm～300 nm），在200 nm附近有最大吸收峰，基線較平穩，因此選擇檢測波長為200 nm。

2.1.2 緩沖溶液pH的選擇

緩沖溶液的pH是影響毛細管電泳分離的首要因素。本試驗配制40 mmol/L的硼砂緩沖液，用0.1 mol/L的NaOH分別調節其pH為9.1、9.3、9.5、9.7、9.9五個梯度，用于考察pH對分離效果的影響，結果見圖1。

圖1 緩沖溶液不同pH對分離效果的影響

由圖1可知，一定程度上，峰值越大，分離效果越好，當pH9.5時，峰值達到最高值11 912 mAu，峰型較好，基線相對最平穩。

2.1.3 緩沖溶液離子濃度的選擇

分別配制10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L的硼砂緩沖液（pH9.5） 系列對標樣進行測定，考察緩沖液的離子濃度對分離效果的影響，結果見圖2。

圖2 緩沖液離子濃度對分離效果的影響

由圖2可知，緩沖液離子濃度為30 mmol/L時得到最大峰值，且基線十分平穩。當離子濃度達到40 mmol/L時，雖然基線也非常平穩，但峰值有下降的趨勢，故采用離子濃度為30 mmol/L。

2.1.4 分離電壓的選擇

在pH為9.5、硼砂緩沖液離子濃度為30mmol/L條件下，考察了8 kV～24 kV電壓對二羥基丙酮標樣保留時間的影響，見下頁圖3。

由圖3可知，隨著分離電壓的升高，保留時間減少，考慮到20 kV基線較穩定，遷移時間適中，所以選擇20 kV作為分離電壓，在電壓為20 kV時，二羥基丙酮標樣的保留時間約為8.3 min，可對二羥基丙酮進行快速測定。

圖3 分離電壓對分離時間的影響

2.2 線性關系

精密稱取二羥基丙酮標準品0.100 0 g，加雙蒸水定容至100 mL，即獲得1 000 μg/mL二羥基丙酮標準溶液，分別精密吸取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL置于10 mL容量瓶中定容得到100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800μg/mL的標準溶液。按1.2.1條件分別進樣測定吸收峰值,以吸收峰值為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線見圖4，并進行線性回歸，得方程y=93.534x-866.35，標準曲線在 100 μg/mL～1 000 μg/mL范圍內線性關系良好，R2=0.999 5。

圖4 毛細管電泳（CE）測定DHA標準曲線

2.3 穩定性實驗

以600 μg/mL的標準溶液按1.2.1最佳電泳條件分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h測定峰面積，其RSD為1.93%，表明在10 h內供試品溶液穩定，結果見表1。

表1 穩定性實驗結果（n=6）

2.4 精密度實驗

以800 μg/mL的標準溶液按上述最佳電泳條件重復進樣6次，測峰值和遷移時間，計算RSD分別為0.96%、0.33%，表明精密度良好，結果見表2。

表2 精密度實驗結果（n=6）

2.5 重復性實驗

取同一菌株產的發酵液，按1.2.1最佳電泳條件分別測定，得到峰值和遷移時間的RSD分別為1.59%、0.39%，表明重現性良好，結果見表3。

表3 重現性實驗結果（n=6）

2.6 加標回收率試驗

分別精密量取已測定二羥基丙酮含量為3.220g/L的同一菌株產的發酵液9份，每份量取2 mL，分別準確加入不同質量濃度二羥基丙酮對照品溶液置于10 mL容量瓶中，加入雙蒸水定容至刻度，用0.45 μm微孔水膜過濾，按照上述最佳電泳條件測定，計算加標回收率，結果平均回收率為97.79%，RSD為1.81%，見表4。

表4 加標回收率實驗結果（n=9）

2.7 樣品的測定

取3份發酵液在上述電泳條件下測定，對照品及樣品色譜圖如圖5，以所得的峰值帶入校準曲線，計算供試樣液中DHA的含量，結果如表5所示。

表5 發酵液中DHA含量的測定結果（n=3）

圖5 標準品和發酵液中DHA毛細管電泳圖對比

3 結論

建立了利用高效毛細管電泳法快速檢測發酵液中1，3-二羥基丙酮含量的方法，以pH9.5的30mmol/L硼砂溶液為緩沖溶液，分離電壓為24kV。該方法具有分離效果好、基線穩定、干擾少、靈敏度高的特點。雖然發酵液成分復雜，在最佳檢測條件下可看到電泳圖譜中有雜峰帶出現，但是對于DHA仍具有較好的分離效果，分離度較高，可有效地將DHA與其他成分分離，為試驗篩選產1，3-二羥基丙酮菌種以及進一步工業化生產中1，3-二羥基丙酮的檢測打下了堅實的基礎。

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Determination of dihydroxyacetone in fermentation broth by capillary electrophoresis

SONGWei*WEI Sheng-huaHUANGMeng-mengTANGBinTAOYu-gui
（College ofbiological and chemical engineering，Anhui polytechnic university，Wuhu 241000，China）

A new rapid and accurate method to determine dihydroxyacetone in fermentation broth was developed by capillary electrophoresis with a fused-quartz capillary （50 μm ×60 cm，45 cm effective length）at detection wavelength of 200 nm and separation voltage of 24 kV.The buffer solution was 30mmol/L borax at pH9.5.The calibration curve was linear in the range from 100 μg/mL to 1 000 μg/mL （R2=0.999 5）for DHA with 3.220 g/L DHA in the fermentation broth was detected by HPLC.The average recovery was 97.79%with RSD of 1.81%.The method was applicable for DHA determination in the fermentation process.

dihydroxyacetone；capillaryelectrophoresis；determination

TS261.7

A

1673-6004（2011）04-0054-02

* 宋煒，男，1987年出生，安徽工程大學生物與化學工程學院在讀碩士研究生。

2011-10-08