米曲霉菌種選育的研究進展

李 晶 馬貴民

（黑龍江生物科技職業學院食品生物系，哈爾濱 150025）

米曲霉菌種選育的研究進展

李 晶*馬貴民

（黑龍江生物科技職業學院食品生物系，哈爾濱 150025）

介紹了誘變育種、原生質體融合及基因工程技術在米曲霉茵種選育中的應用及研究進展。

米曲霉；誘變育種；原生質體融合

米曲霉（Aspergillus oryzae）是發酵工業常用的生產菌種，分類上歸屬于半知菌亞門，是曲霉屬真菌中的一個常見種，該菌株酶系廣泛，除產蛋白酶外，還可產淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、植酸酶等，可被廣泛應用于釀造酒、調味品和飼料生產等發酵工業，并已被安全地應用了1 000多年。然而在發酵生產過程中，由于長期的移種和保藏，菌種會出現退化，導致米曲霉酶活性和代謝能力降低，嚴重影響產品的產量和品質，因此，菌種選育工作就顯得十分重要了。近年來國內外育種工作者們利用不同的育種方法對米曲霉菌種進行定向改良，優化菌種資源，并已取得了顯著的成績。

1 米曲霉誘變育種的研究

誘變育種是當前菌種選育的一種主要方法，在生產實踐中使用的十分普遍。誘變育種和其他育種方法相比，具有明顯的優勢，操作速度快、收益大、方法簡單，但是誘變育種缺乏定向性，因此誘變突變必須與大規模的篩選工作相配合才能收到良好的效果。目前，誘變育種仍然是米曲霉菌種選育的主要方法。

米曲霉的誘變育種一般采用對細胞或原生質體進行物理及化學誘變，來篩選出高產各種酶類的菌株，我國開展這項育種工作已有50多年的時間了，許多研究機構在這方面都做了大量的工作，并取得了可喜的成績。目前國內大部分釀造廠一直沿用至今的滬釀3.042米曲霉是林祖申先生在20世紀60年代用紫外線誘變和高蛋白質馴養選育出的，該菌株具有生長快、孢子多，制曲管理容易等優點，頗受生產單位歡迎。為了進一步提高原料利用率，降低生產成本，林祖申先生以瀘釀3.042米曲霉為出發菌株，采用快中子、鈷60γ-射線、紫外線、甲基磺酸乙酯（EMS）、氯化鋰等交替誘變育種，篩選出了UE336-2新菌種，并測得中性蛋白酶活力比對照菌提高1倍以上，將其應用于醬油生產，原料全氮利用率可提高7.3%。

在近十年時間里，米曲霉的誘變育種工作也取得了顯著成績。周其洋以米曲霉1-7.3為出發菌株,經過紫外誘變、初篩得到生長速度快、孢子顏色和菌落形態發生變化的菌株125株，再經過制曲復篩進一步得到了一株綜合酶系優良的目標菌株80 110，該菌株在多種酶系的活力上都有明顯的提高。邵偉等以滬釀3.042為出發菌株，經對其孢子進行紫外線和硫酸二乙酯復合誘變，經溫度選擇培養，得到一株變異菌株A11。該菌株在45℃條件下仍能生長發育，且蛋白酶活性高，有較好的遺傳穩定性。郭繼平等以從自然發酵黃豆醬中篩選的5株野生米曲霉為供試菌株，篩選出米曲霉K61作為誘變出發菌株，采用紫外誘變對米曲霉K61菌株進行改造，篩選出一株蛋白酶活力高且遺傳性能穩定的突變株Y29。該菌株應用于黃豆醬的生產中，蛋白酶活力明顯高于米曲霉滬釀3.042菌株，且米曲霉Y29的醬香更濃郁一些，氨基酸態氮含量也高于米曲霉滬釀3.042菌株。馬瓊以米曲霉作為原始菌株，經硫酸二乙酯（DES）、紫外線照射復合誘變，得到一株高產纖維素酶的突變菌株Ⅱ5，其纖維素酶活力高達100.23 U/100mL，為出發菌株的1.39倍。

隨著研究方法的不斷深入，新的誘變育種方法也在得到不斷地嘗試。鄧靜等以去壁米曲霉孢子為誘變對象，采用Licl2微波、DES2超聲波復合誘變，最終選出1株高產酸性蛋白酶的菌株C2，其產酸性蛋白酶活力是原始菌株的135.0%。王華等以米曲霉3.042一級菌種為出發菌株，采用不同壓力梯度處理米曲霉孢子懸液，篩選獲得了一株可穩定遺傳的HP300a理想變異菌株，這是高壓誘變法在米曲霉菌種選育中的首次嘗試，他不僅為高壓誘變篩選米曲霉優良菌種提供了一定的理論依據，而且也為運用高壓技術誘變菌種這一新的領域提供了理論依據。離子注入誘變育種技術是近些年發展起來的物理誘變技術，作為一項微生物新型誘變方法已經得到了廣泛的應用并且取得了相當的成就。曹小紅等選用N＋離子注入的方法對3.042米曲霉進行誘變育種，篩選得到蛋白酶活力有所提高的突變菌種TK-7，該菌株在三角瓶曲的蛋白酶活和原菌株相比提高了36%，誘變試驗效果顯著。

國外科研人員對米曲霉的誘變育種研究的也很多，如井口氏對米曲霉生產菌種曾進行過Χ線照射誘變，得到蛋白酶活力比原出發菌株高2倍的X-816菌株，那須野氏再次誘變，把X-816的蛋白酶活提高到6倍，所得到的變異株與原出發菌株的酶系統沒有改變。Biesebeke等對米曲霉進行誘變育種，結果表明，突變后菌株產淀粉酶活力提高50%，葡萄糖化酶活力提高近100%，蛋白酶活力提高90%。

2 原生質體融合技術在米曲霉菌種選育中的應用

自1974年匈牙利的FerenczyL等采用離心力誘導的方法，首次報道了白地霉營養缺陷型突變株的原生質體融合方法以后，原生質體融合技術就成為了微生物育種的一項新技術。米曲霉是食品釀造工業中的重要微生物，利用原生質體融合技術選育優良米曲霉菌株一直是國內外育種工作者研究的熱點問題。

我國米曲霉原生質體融合技術研究開始于20世紀80年代，邢來君等人首先對米曲霉原生質體的制備和再生條件進行了研究，隨后對米曲霉進行了原生質體的營養互補融合，成功獲得了融合子，融合頻率為0.24%～0.47%。20世紀90年代，辛明秀等采用混合酶液處理米曲霉3.042營養缺陷型菌絲獲得原生質體，以PEG為融合劑進行融合處理，成功地獲得米曲霉原生質體的營養互補融合。早期的米曲霉原生質體融合技術均采用的是營養缺陷型親本，但是營養缺陷型親本菌株遺傳標記的誘變篩選既費時又費力，而且會帶來一些不良突變。近10年里，育種工作者們在米曲霉的融合方法上做了大量的研究，普遍采用雙親滅活原生質體融合的方法，彌補了不足，并取得了可喜的成績。唐潔等對米曲霉CICC2339和米曲霉AS3.951菌株的原生質體分別進行了微波和紫外滅活，然后在融合劑的作用下對滅活雙親進行融合，篩選出3株生長速度快且蛋白酶活力高的融合株。王燕對米曲霉（AS3.951） GIM3.13和CICC2339的原生質體分別進行熱滅活及紫外滅活，然后對滅活雙親用PEG作融合劑進行原生質體融合，篩選出來比親本產酶高的融合株。唐潔等人還采用了電誘導融合的方法，成功獲得了融合菌株。日本曾在1983年和1984年分別報道了利用原生質體融合技術改良米曲霉生長特性及蛋白酶活性而進行醬油菌種的育種工作。

3 基因工程技術在米曲霉菌種選育中的應用

隨著基因技術的飛速發展，人們開始利用基因工程技術進行菌株改造，以獲得更符合生產需要的優異菌株。陸健等運用PCR介導的定點突變對米曲霉來源的木聚糖酶在畢赤酵母中的重組表達進行了研究，獲得1個表達量遠遠高于親本的突變株I156A。X.F.Zheng等人通過構建一株由反義RNA表達而低產絲氨酸羧肽酶的米曲霉突變株，實現了高產多種蛋白酶的愿望。在醬油生產過程中，羧肽酶和堿性蛋白酶與氨基酸的生成直接相關，目前這兩種酶的基因已成功克隆并轉化，在新構建的基因工程菌株中堿性蛋白酶的活力可提高5倍，羧肽酶的活力可大幅度提高13倍。另外醬油制造中和壓榨性有關的多聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、纖維素酶和果膠酶等的基因均已被克隆，當用高纖維素酶活力的轉基因米曲霉生產醬油時，可使醬油的產率明顯提高。

日本研究人員在2005年成功破譯了米曲霉的基因組，在基因組已被破譯的微生物中，米曲霉的堿基對數目是最多的。米曲霉含有大量與蛋白質和脂肪分解酶相關的基因，能夠把蛋白質分解成讓釀造食品更具美味的氨基酸。研究人員認為，基因組所包含的信息可以用來尋找最適合米曲霉發酵的條件，這將有助于提高食品釀造業的生產效率和產品質量，為發酵食品的生產提供更為有利的依據。

4 展望

目前米曲霉菌種選育已取得了顯著的成績，許多優良的菌種被選育出來并用于國內外的工業化生產。傳統的誘變育種和原生質體融合技術在米曲霉菌種選育上已經得到了廣泛的應用，但還存在一些問題，如隨意性較大，缺少定向性。隨著對米曲霉分子生物學研究的不斷深入，以基因工程技術為主的多樣化育種方式將會應用到米曲霉的選育中，并為高品質產品的開發提供一個嶄新的途徑。

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The research progress ofaspergillus oryzae in strain breeding

LI Jing*MAGui-min
（Department offood biotechnology，Heilongjiangvocational college ofbiologyscience and technology，Harbin 150025，China）

The application and research progress of mutation breeding,protoplast fusion and gene engineering technologies on aspergillus oryzae in strain breedingwere reviewed.

aspergillus oryzae；mutation breeding；protoplast fusion

TS261.+2

A

1673-6004（2011）04-00011-03

* 李晶，女，1978年出生，2004年畢業于齊齊哈爾大學遺傳學專業，碩士，講師。

2011-11-21