黑龍江漢族速滑運(yùn)動員優(yōu)秀耐力能力與肌型肌酸激酶基因（CKMM）A/G多態(tài)的關(guān)聯(lián)研究

周文婷，李麗文，劉向宇

（1.哈爾濱體育學(xué)院 運(yùn)動人體科學(xué)系，黑龍江 哈爾濱 150008；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030）

肌酸激酶（CK）是一個與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)，肌肉收縮，ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶［1-2］，它可逆地催化肌酸（Cr）與ATP之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)，是該反應(yīng)的關(guān)鍵酶。CK與磷酸肌酸（PCr ）組成肌酸-磷酸肌酸穿梭系統(tǒng)，可作為細(xì)胞內(nèi)“暫時的能量緩沖系統(tǒng)”，用以在高能量需求時維持細(xì)胞內(nèi)的ATP/ADP比率［3］；同時作為能量轉(zhuǎn)運(yùn)單位, 該系統(tǒng)亦作用于將能量從產(chǎn)生部位轉(zhuǎn)運(yùn)至利用部位。CK有4種同工酶形式，分別為肌肉型（MM）、腦型（BB）、雜化型（MB）和線粒體型（MiMi），其中CKMM主要表達(dá)于骨骼肌中，在心肌中也有少量表達(dá)。肌肉中CKMM主要集中在M線附近［4］，主要功能是在肌球蛋白頭部生成高濃度的ATP，為肌肉收縮及運(yùn)動供能。此外，CKMM在肌質(zhì)網(wǎng)（SR）Ca2+ ATP酶的附近也有表達(dá)［5］，作用可能涉及Ca2+的再聚集［6］，進(jìn)而影響肌肉的工作能力。

人的CKMM基因位于染色體的19q13.2～q13.3區(qū)域，長度約有17.5 kb，包含8個外顯子和7個內(nèi)含子。研究表明，在CKMM基因3′端非編碼區(qū)存在可能與耐力有關(guān)的CKMM-NcoⅠ多態(tài)位點(diǎn)，且該位點(diǎn)在我國北方漢族人群中的分布與歐美人群相比具有非常顯著性差異［7］；在對耐力訓(xùn)練效果與該位點(diǎn)多態(tài)間的關(guān)系進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，CKMM基因與跑節(jié)省化（RE）指標(biāo)有關(guān), 該位點(diǎn)不同基因型攜帶者對耐力訓(xùn)練的敏感性具有顯著性差異［8］，而該位點(diǎn)與個體50W負(fù)荷時心臟收縮功能對耐力訓(xùn)練的敏感性亦存在關(guān)聯(lián)［9］，從而提示該位點(diǎn)可能與我國北方漢族人的耐力訓(xùn)練效果相關(guān)，這對于了解運(yùn)動訓(xùn)練中個體差異的產(chǎn)生原因，科學(xué)制定個性化訓(xùn)練方案提供了理論依據(jù)。

黑龍江省是冰雪運(yùn)動大省，各種冰雪項(xiàng)目，尤其是速滑項(xiàng)目在國際上享有盛譽(yù)。黑龍江省冰雪項(xiàng)目運(yùn)動員作為國家隊隊員的主要后備力量，其選材歷來備受矚目，具有優(yōu)秀的耐力素質(zhì)的耐力型速滑運(yùn)動員更是選材的重點(diǎn)。然而，當(dāng)前CKMM基因NcoⅠ位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究后繼乏力，對其適用性尚無更多佐證。故本研究對黑龍江籍漢族優(yōu)秀耐力型速滑運(yùn)動員的CKMM-NcoⅠ位點(diǎn)多態(tài)分布進(jìn)行探索，旨在探尋該多態(tài)位點(diǎn)分布與速滑運(yùn)動員優(yōu)秀耐力素質(zhì)間的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步開展群體遺傳學(xué)和體育科學(xué)研究提供有益的資料。

1 實(shí)驗(yàn)對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

健康大學(xué)生120例，其中男性82人，女性38人，所有研究對象均為黑龍江籍漢族，彼此無血緣關(guān)系，受試者基本情況見表1。優(yōu)秀耐力項(xiàng)目速滑運(yùn)動員25例，其中男性11人，女性14人，均為黑龍江籍漢族，彼此無血緣關(guān)系，基本情況見表2。

表1 大學(xué)生受試者基本情況

表2 速滑運(yùn)動員基本情況

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取靜脈血2mL，2%EDTA抗凝，分離白細(xì)胞，-20℃保存。采用Promega公司試劑盒提取基因組DNA。PCR-RFLP法解析NcoⅠ位點(diǎn)基因型，PCR擴(kuò)增引物序列如下：

F:GGGATGCTCAGACTCACAGA；R:AACTTGAATTTAGCCCAACG。

PCR反 應(yīng) 體系為：PCR反 應(yīng) buffer 2μL，1.5mmol/LmgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μmol/L，上、下引物各0.5μmol/L，Taq酶1U，模板100ng，無菌水補(bǔ)足至20μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性7min，94 ℃變性40s，50℃退火40s，72 ℃延伸60s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖中進(jìn)行電泳，90V 40min檢驗(yàn)擴(kuò)增效果。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7 μL、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ1μL（8 U）、10×緩沖液2 μL和0.1% BSA 2 μL于37 ℃酶切8 h。酶切產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)紫外光成像。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以χ2檢驗(yàn)計算基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。采用r×c列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)計算與其他人群的基因型分布差異。檢驗(yàn)顯著性水平定為P ＜ 0. 05，非常顯著性差異定為P ＜ 0. 01。

2 結(jié)果與分析

CKMM基因經(jīng)PCR及NcoⅠ內(nèi)切酶消化以后得到3種條帶：有酶切位點(diǎn)的純合型有153 bp /206 bp 兩條帶，沒有酶切位點(diǎn)的純合型只有359 bp 1條帶，而雜合型有153 bp /206 bp + 359 bp 3條帶，其中153 bp + 206 bp /153 bp + 206 bp 是A/A純合型，359 bp/359 bp是G/G純合型，153 bp + 206 bp/359 bp是A/G雜合型。

3種基因型在健康大學(xué)生及耐力型速滑運(yùn)動員中的分布經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律( P ＞ 0. 05)，具有群體代表性。不同性別受試者在NcoⅠ位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率均無顯著性差異，與周多奇等［7］研究結(jié)果相似，表明黑龍江籍漢族人在該位點(diǎn)與所涉地域更廣的我國北方漢族人多態(tài)分布相近，具有典型的北方漢族群體遺傳特征，具體分布見表3。

表3 黑龍江漢族大學(xué)生及耐力型速滑運(yùn)動員CKMM 基因NcoⅠ位點(diǎn)多態(tài)性分布

與加拿大、西班牙和意大利人群相比，包括黑龍江在內(nèi)的我國北方漢族人及黑龍江耐力型速滑運(yùn)動員在該位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率與他們均有非常顯著性差異（P ＜ 0. 01），而與韓國人相比，基因型頻率和等位基因頻率差異均不顯著。在對其他種族間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，韓國人與各歐美人群在等位基因頻率和基因型頻率上均呈顯著性差異（P ＜ 0.05），而歐美各國人群組間則均無顯著性差異（見表4）。

表4 不同種族人群CKMM 基因NcoⅠ位點(diǎn)多態(tài)性分布

個體間體質(zhì)和運(yùn)動能力的差異受多種因素影響，其中環(huán)境（運(yùn)動訓(xùn)練、營養(yǎng)與技術(shù)方法）和遺傳因素在很大程度上起決定作用。而在相同的環(huán)境下，不同的遺傳背景可能是影響個體間不同體質(zhì)、不同運(yùn)動能力的主要原因。1998年Montgomery等［16］對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因ACE進(jìn)行的劃時代研究開啟了運(yùn)動能力相關(guān)基因多態(tài)研究的新領(lǐng)域。隨著生物技術(shù)與分子遺傳學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，迄今已有包括214個常染色體基因位點(diǎn)、7個X染色體位點(diǎn)和18個mtDNA序列多態(tài)性位點(diǎn)在內(nèi)的，與人類體質(zhì)和優(yōu)秀運(yùn)動能力有關(guān)的基因位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)和定位［17］，其中有關(guān)耐力素質(zhì)的研究較多，發(fā)現(xiàn)也較集中，極大豐富了人們對不同種族、不同地域人群體質(zhì)和運(yùn)動能力差異性原因和機(jī)制的認(rèn)識，也更好地促進(jìn)了群體遺傳學(xué)的發(fā)展。作為運(yùn)動能力的重要組成部分，耐力素質(zhì)是多基因控制的復(fù)雜表型。有人研究了多個代謝基因?qū)δ土\(yùn)動員體型、慢肌纖維比例及最大氧消耗量的綜合作用，發(fā)現(xiàn)了10個與耐力相關(guān)的基因多態(tài)型，而這些基因多態(tài)型在運(yùn)動員中表達(dá)的數(shù)量越多，運(yùn)動員的慢肌纖維比例越高，氧消耗量越大，耐力素質(zhì)也越好［18］。隨著高通量SNP分析技術(shù)的應(yīng)用，更快更方便的全基因組測序技術(shù)的發(fā)展，基因間的微小、多重、積累的相互作用將被檢測，“運(yùn)動基因”的探尋進(jìn)程有望加快，通過分子技術(shù)進(jìn)行優(yōu)秀運(yùn)動員選材的愿望將更快實(shí)現(xiàn)［19］。

CKMM基因NcoⅠ多態(tài)性是除ACE基因I/D多態(tài)性、ACTN3基因rs540874多態(tài)性外，已報道的可能與耐力運(yùn)動能力和耐力訓(xùn)練敏感性相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)，其中雜合型A/G攜帶者被認(rèn)為可能具有更高的耐力水平和更高的訓(xùn)練敏感性［7，20-21］，周多奇等［7-9］對我國北方漢族人耐力訓(xùn)練敏感性的研究也對此也予以了證實(shí)。然而，CKMM基因NcoⅠ位點(diǎn)多態(tài)性的應(yīng)用性研究后繼乏力，冰雪項(xiàng)目更是從未涉及，故本文首次對冰雪項(xiàng)目運(yùn)動員的優(yōu)秀耐力素質(zhì)與該位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑龍江籍漢族人中A/G基因型的頻率為22%，與我國北方漢族人（24%）中該基因型頻率相似，與韓國人（31%）相比差異也不顯著（P＞0.05），但與歐美各國人相比，其分布頻率非常顯著低于各國（35%～54%）（P＜0.01）；而在韓國人中，其分布頻率也顯著低于歐美各國（P＜0.05），歐美各國人間其分布頻率則無顯著性差異（P＞0.05），表明CKMM基因NcoⅠ多態(tài)性可能存在種族及地域上的顯著差異，而這或許正是亞洲地區(qū)與歐美地區(qū)人群間存在較大體質(zhì)和耐力水平差異的原因之一。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，黑龍江優(yōu)秀耐力型速滑運(yùn)動員中A/G基因型的頻率為32%，略高于包括黑龍江省在內(nèi)的我國北方漢族人中該基因型的頻率（22%及24%），與韓國人（31%）結(jié)果非常相似（P＞0.05），無顯著性差異，表明黑龍江漢族耐力型速滑運(yùn)動員在CKMM基因NcoⅠ多態(tài)位點(diǎn)的分布與優(yōu)秀耐力素質(zhì)無關(guān)，該位點(diǎn)不能作為其耐力素質(zhì)選材的遺傳學(xué)標(biāo)記，速滑運(yùn)動員的優(yōu)秀耐力素質(zhì)更多受到其它環(huán)境因素（運(yùn)動訓(xùn)練、營養(yǎng)與技術(shù)方法）的影響。當(dāng)然，由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計及研究樣本量所限，很多研究都可能出現(xiàn)結(jié)論的相悖，然而隨著后基因組計劃及群體遺傳學(xué)的的深入開展，相信大量的遺傳學(xué)信息將會逐漸彌補(bǔ)這些缺憾，而本研究也將在未來進(jìn)一步加大樣本含量，以期更準(zhǔn)確地描述該基因多態(tài)位點(diǎn)的分布特征。

3 結(jié)論

綜上，研究首次對黑龍江漢族耐力型速滑運(yùn)動員在CKMM基因NcoⅠ位點(diǎn)的多態(tài)分布進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，等位基因頻率分別為A=84%和G=16%，基因型頻率分別為A/A=68%、A/G=32%，基因型和等位基因頻率在男性和女性間無顯著性差異（P＞0.05），與歐美人群相比頻率差異具有顯著性（P＜0.05），而與包括黑龍江省在內(nèi)的我國北方漢族人及韓國人相比差異不顯著（P＜0.05），故該位點(diǎn)不能作為其耐力素質(zhì)選材的遺傳學(xué)標(biāo)記。雖然如此，研究對我國北方漢族人，尤其對黑龍江漢族優(yōu)秀運(yùn)動員在CKMM基因NcoⅠ位點(diǎn)的多態(tài)分布信息進(jìn)一步予以了補(bǔ)充，為后續(xù)更加深入的群體遺傳學(xué)研究和運(yùn)動能力的分子生物學(xué)研究亦提供了有用的資料。

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