水蛭素對(duì)皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞bFGF及TGFβ1表達(dá)的影響

[摘要]目的：檢測(cè)水蛭素對(duì)人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞堿性成纖維細(xì)胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta 1，TGFβ1）表達(dá)的影響，探討水蛭素抑制瘢痕形成的作用及機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)并鑒定人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測(cè)不同濃度水蛭素作用人成纖維細(xì)胞24h后，bFGF、TGFβ1的mRNA和bFGF、TGFβ1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：濃度為0.156～2.5 U/L的水蛭素可下調(diào)瘢痕成纖維細(xì)胞TGFβ1 mRNA、蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)bFGF的mRNA、蛋白的表達(dá)，不同濃度組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。水蛭素可抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分泌TGFβ1，促進(jìn)其分泌bFGF。結(jié)論：水蛭素抑制瘢痕可調(diào)節(jié)bFGF、TGFβ1分泌，由此抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖并進(jìn)一步抑制瘢痕形成。

[關(guān)鍵詞]瘢痕；水蛭素；成纖維細(xì)胞；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2011）04-0614-04

Effects of Hirudin on expression of bFGF， TGFβ1 in dermal hypertrophic scar fibroblasts

GUO Rui1，NONG Xiao-lin1，2，DENG Ling1，LI Jia-quan3，LI Ju-shang4，LI Yan-ning5，LI Hao1

（1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Collage of Stomatology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China; 2.School Library of Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China;3. Medical Research Center of Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China; 4.Dermatology and Venerology Department， The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China; 5.Department of statistics，College of Public Health，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of Hirudin on the expression ofbasic fibroblast growth factor (bFGF) and transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) in human hypertrophy scar dermal fibroblasts in vitro， therefore to explore the role of bFGF and TGFβ1 on hypertrophy scaring.MethodsHuman dermal hypertrophy scar derive fibroblasts were obtain through primary culture. Dermal hypertrophy scar fibroblasts were cultured in vitro with Hirudin for 24 hours; mRNA levels of bFGF and TGFβ1 in treated fibroblasts were detected by Realtime RT-PCR， and proteinlevels of bFGF，TGFβ1 in fibroblasts were detected by immunocytochemistry.Results0.156～2.5 U/L Hirudin statistically up-regulated level of bFGF mRNA， bFGF(P<0.05)， and obviously down-regulated level of TGFβ1 mRNA，TGFβ1 (P<0.05) in hypertrophic scar fibroblasts.ConclusionsHirudin inhibited the secretion of TGFβ1 and facilitated that of bFGF in scar derive fibroblast.bFGF and TGFβ1 could be a regulation target on the growth and proliferation of fibroblasts during scar formation under Hirudin treatment.

Key words: scar; Hirudin; fibroblast; basic fibroblast growth factor; transforming growth factor beta 1

皮膚瘢痕是臨床常見而治療非常棘手的疾病群，可對(duì)人體形態(tài)和功能造成較大影響，但常規(guī)應(yīng)用的治療方法效果均不理想。中藥對(duì)瘢痕的防治有著久遠(yuǎn)的歷史，在保護(hù)組織免受損傷及促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等方面有一定功效。近年隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)瘢痕發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究的進(jìn)一步深入，細(xì)胞因子在瘢痕形成過(guò)程中的作用越來(lái)越受到重視。本項(xiàng)目組前期研究顯示：水蛭素對(duì)人瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性瘢痕模型也有較好的治療效果[1-3]。本研究采用天然水蛭素作用于體外培養(yǎng)人皮膚瘢痕組織成纖維細(xì)胞，檢測(cè)bFGF、TGFβ1在藥物處理前后的表達(dá)差異，進(jìn)一步探討其藥物作用的機(jī)理。

1材料和方法

1.1 試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基目（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（美國(guó)sigma公司），鼠抗人波形蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司），天然水蛭素（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院），human TGFβ1、bFGF、及GAPDH引物（TaKaRa公司），Realtime RT-PCR反應(yīng)儀（美國(guó)Bio-RadiCycler iQ）、兔抗人bFGF多克隆抗體、兔抗人TGFβ1多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司），免疫組化試劑盒、DAB顯示試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：組織標(biāo)本供體均來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形美容外科的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)為近期未使用瘢痕抑制藥物，不伴有其他系統(tǒng)性疾病，經(jīng)過(guò)臨床和病理診斷證實(shí)，取材前均經(jīng)患者知情同意。參考Veelken H[4]的方法進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)， 反復(fù)傳代去除非成纖維細(xì)胞成分后，建立人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)取第3～6代的成纖維細(xì)胞用于試驗(yàn)。抗波形蛋白抗體免疫細(xì)胞化學(xué)SP法鑒定培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，以PBS緩沖液替代一抗為空白對(duì)照。

1.2.2 Realtime RT-PCR檢測(cè)水蛭素不同濃度作用下bFGF、TGFβ1 mRNA表達(dá)

1.2.2.1 藥物作用后成纖維細(xì)胞總RNA的提取和檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增生性瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，標(biāo)本置于含青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/L的D'hanks液中培養(yǎng)3天后，更換為無(wú)血清的濃度為0 U/L、0.156U/L、0.625U/L、2.5U/L的含水蛭素培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后將經(jīng)形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)SP法鑒定的細(xì)胞按TRIZOL法的操作步驟提取總RNA，并以O(shè)D260/OD280比值為依據(jù)測(cè)定總RNA的純度和濃度。

1.2.2.2 cDNA合成：各處理組提取的總RNA各取2ng進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，5×PrimeScriptTMBuffer 2μl，Random 6mers 0.5μl，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，并補(bǔ)足RNase Free H2O使體系為10μl，37℃ 15min，85℃ 5s。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 引物合成：根據(jù)Genebank人bFGF、TGFβ1的cDNA序列，結(jié)合文獻(xiàn)，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，選用保守的GADPH為熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR內(nèi)參基因。所有引物由大連TaKaRa公司合成（見表1）。

1.2.2.4 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

(1) cDNA的制備：冰浴下，在0.5mlEppendorf管內(nèi)依次加入5×PrimeScriptTMBuffer 2μl、Random 6 mers0.5μl、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5μl、Oligo dT Primer 0.5μl、RNA模板2μl、RNase Free H2O 4.5μl。每管總體系10μl，混勻離心2～3s。反應(yīng)條件為37℃ 15min，85℃ 5s。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 熒光定量RT-PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2.5μl、25mM MgCl22.5μl、10 mM dNTP 0.5μl、上下游引物各0.5μl、Taq DNA(1U/μl) 0.5μl、20×SYBR Green Ⅰ染料 1μl、模板 2μl，加滅菌去離子水至總體積 25μl。

（3） 反應(yīng)循環(huán)：95℃預(yù)變性10s，1個(gè)循環(huán)5min；95℃ 變性45s；72℃ 延伸 60 s；退火溫度bFGF為 58℃，TGFβ1為61℃，內(nèi)參基因GAPDH為62℃共40個(gè)循環(huán)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化由實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀監(jiān)測(cè)。所有樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均包含1個(gè)無(wú)模板的陰性對(duì)照以排除假陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.2.5 Real-Time PCR 產(chǎn)物定量分析：PCR反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果（依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣本的CT值計(jì)算出該樣品對(duì)應(yīng)的起始cDNA水平）。結(jié)果以拷貝數(shù)/μl cDNA表示，并以此比值做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.2.6 瓊脂糖凝膠電泳：為進(jìn)一步確認(rèn) PCR反應(yīng)的特異性，將bFGF、TGF1擴(kuò)增產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。一旦PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度確認(rèn)，即應(yīng)用SYBRGreen I實(shí)時(shí)定量PCR熔解曲線中的熔解溫度Tm監(jiān)測(cè)反應(yīng)特異性。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)不同濃度青蒿琥酯鈉作用下bFGF、TGFβ1蛋白的表達(dá)

1.2.3.1 藥物作用：取前述實(shí)驗(yàn)分離的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3～6代實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組成纖維細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)為1×105/ml，分別接種于6孔板中，將消毒處理后的蓋玻片置于孔板中，常規(guī)培養(yǎng)72h后吸棄原培養(yǎng)液。用培養(yǎng)液稀釋成0.156U/L，0.625U/L，2.5U/L的含水蛭素培養(yǎng)液。每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃，5%CO2飽合濕度繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.3.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色：取出生長(zhǎng)細(xì)胞后的蓋玻片，常規(guī)固定、晾干、PBS沖洗；5～10%正常山羊血清封閉；分別滴加兔抗人bFGF、TGFβ1多克隆抗體（抗體滴度為1:200，4℃過(guò)夜）；1%BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記二抗（37℃孵育30min）；PBS稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（37℃孵育30min）；DAB顯色劑顯色；蘇木精復(fù)染；中性樹膠封片。在染色過(guò)程中，每例均以PBS緩沖液代替一抗作空白對(duì)照。

1.2.3.3 觀察方法和結(jié)果判定：bFGF、TGFβ1陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞胞漿，顯微鏡下細(xì)胞漿染成棕黃色。采用德國(guó)萊卡病理圖像分析儀（DMR+Q550型）進(jìn)行灰度值測(cè)定分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析：利用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料采用成組設(shè)計(jì)方差分析及兩兩比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)及鑒定:光鏡下細(xì)胞胞體狹長(zhǎng)、透亮，胞膜清晰，呈典型的梭形和不規(guī)則三角形；HE染色見成纖維細(xì)胞胞漿豐富，色淡紫，胞核大，色藍(lán)，位于細(xì)胞中央；抗波形蛋白抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性率為100%，胞漿內(nèi)見大量棕黃色顆粒，核為藍(lán)色，空白對(duì)照未見陽(yáng)性表達(dá)。

2.2 藥物對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞bFGF、TGFβ1 mRNA表達(dá)的影響

2.2.1 水蛭素作用24h對(duì)bFGF、TGFβ1 mRNA表達(dá)的影響：Realtime RT-PCR檢測(cè)濃度為0 U/L、0.156U/L、0.625U/L、2.5U/L的含水蛭素培養(yǎng)液培養(yǎng)液作用24h對(duì)體外培養(yǎng)瘢痕成纖維細(xì)胞bFGF、TGFβ1 mRNA表達(dá)的結(jié)果見表1。數(shù)據(jù)經(jīng)成組設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示：P＜0.05，各組bFGF、TGFβ1 mRNA含量不同或不完全相同。不同藥物濃度組間經(jīng)兩兩比較分析顯示各組間均存在顯著差異（P＜0.05），且bFGFmRNA含量為：0U/L＜0.156U/L＜0.625U/L＜2.5U/L；而TGFβ1 mRNA含量為：2.5U/L＜0.625U/L＜0.156U/L＜0U/L。表明水蛭素作用于體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞可上調(diào)bFGF mRNA表達(dá)，同時(shí)下調(diào)TGFβ1 mRNA表達(dá)。

2.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物鑒定：實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析圖（圖1）。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)水蛭素作用下bFGF、TGFβ1蛋白的表達(dá)：濃度為0.156U/L、0.625U/L、2.5U/L的水蛭素作用于體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞后結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)經(jīng)成組設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示：P＜0.05，各組bFGF、TGFβ1 蛋白含量不同或不完全相同。不同藥物濃度組間經(jīng)兩兩比較分析顯示各組間均存在顯著差異﹙P＜0.05﹚，且bFGF灰度值為：2.5U/L＜0.625U/L＜0.156U/L＜0 U/L；而TGFβ1 灰度值為：0 U/L＜0.156U/L＜0.625U/L＜2.5U/L。表明水蛭素作用可上調(diào)bFGF蛋白表達(dá)(表2，圖2)，同時(shí)下調(diào)TGFβ1 蛋白的表達(dá)(表2，圖3)。

3討論

水蛭素是一種抗凝物質(zhì)[5]，分為天然水蛭素和人工水蛭素。天然水蛭素是作用很強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑，是水蛭唾液腺的一種分泌物質(zhì)，它由65個(gè)氨基酸殘基組成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為單鏈環(huán)肽化合物，與凝血酶結(jié)合可形成一種非共價(jià)復(fù)合物，這種復(fù)合物可以中和凝血酶，特異性地抑制凝血酶的活性，具有多方面的用途。水蛭素還具有抑制細(xì)胞增生的作用。周小明等[6]觀察了水蛭素對(duì)培養(yǎng)的兔胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及對(duì)3H-TDR攝取的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水蛭素通過(guò)抑制兔平滑肌細(xì)胞對(duì)3H-TDR攝取而影響細(xì)胞DNA的合成，從而抑制了細(xì)胞的增殖。易文龍等[7]研究發(fā)現(xiàn)水蛭素等能使肝纖維化動(dòng)物血清I型前膠原及III型前膠原含量減少，從而達(dá)到減少肝纖維化的作用。

成纖維細(xì)胞是重要的創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞，它可以分泌多種細(xì)胞因子參與創(chuàng)口的愈合。在瘢痕形成過(guò)程中，正向與負(fù)向兩類細(xì)胞因子調(diào)控成纖維細(xì)胞的增生與代謝活動(dòng)，從而決定膠原等細(xì)胞外基質(zhì)形成與降解之間的動(dòng)態(tài)平衡。這些細(xì)胞因子表達(dá)水平及功能的變化，可能導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和膠原基質(zhì)的過(guò)度沉積，進(jìn)而形成病理性瘢痕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)是一種纖維化促進(jìn)因子，是目前已知的與病理性瘢痕關(guān)系最密切的細(xì)胞因子，TGFβ1可促進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，增強(qiáng)纖維蛋白和膠原分泌[8-9]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族原型，可通過(guò)與成纖維細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，下調(diào)病理性瘢痕組織中I型前膠原mRNA表達(dá)，提高膠原酶mRNA水平，刺激膠原酶合成[10]，減少硫酸軟骨素粘多糖產(chǎn)生，抑制纖維素合成，防止過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積[11]。

本實(shí)驗(yàn)采用天然水蛭素作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：水蛭素可下調(diào) TGFβ1 mRNA和蛋白水平表達(dá)，同時(shí)上調(diào)bFGF的mRNA和蛋白水平表達(dá)，作用效果呈劑量依賴性。提示水蛭素這種藥物對(duì)瘢痕應(yīng)有治療效果。據(jù)此推測(cè)其治療機(jī)制為，水蛭素可能抑制TGFβ1在瘢痕發(fā)生初期的表達(dá)，減少組織中成纖維細(xì)胞的增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，避免大量的纖維化組織形成，進(jìn)而防止瘢痕增生；而水蛭素可能促進(jìn)bFGF下調(diào)病理性瘢痕組織中 I型前膠原 mRNA表達(dá)，刺激膠原酶合成，防止過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。并且體內(nèi)各種細(xì)胞因子具有網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的特點(diǎn)，它們相互促進(jìn)與拮抗，相互調(diào)節(jié)受體的表達(dá)。

探明細(xì)胞因子在創(chuàng)傷修復(fù)及皮膚病理性瘢痕形成中所起的作用，有助于明確瘢痕形成的機(jī)制；而開發(fā)利用中藥、天然藥物對(duì)皮膚瘢痕修復(fù)過(guò)程的中良性調(diào)節(jié)機(jī)制是今后研究的又一個(gè)突破點(diǎn)，不失為瘢痕防治一種好的選擇。

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[收稿日期]2011-01-26[修回日期]2011-03-20

編輯/張惠娟