預(yù)構(gòu)皮瓣再血管化的研究進(jìn)展

近年來，工業(yè)、交通、能源等呈現(xiàn)高速發(fā)展，與此相關(guān)的大面積創(chuàng)傷、組織缺損病例也在逐年增加。這類創(chuàng)傷在修復(fù)后多遺留不同程度的畸形和功能障礙，尤其是顏面部創(chuàng)傷畸形，其治療仍是整形外科一個(gè)非常棘手的問題。該部位修復(fù)要求高、供區(qū)少，常規(guī)治療方法如植皮、皮瓣、皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)等很難達(dá)到滿意的治療效果。預(yù)構(gòu)皮瓣已逐漸成為一種有效治療創(chuàng)傷復(fù)雜且修復(fù)要求高的畸形或缺損的手段。

預(yù)構(gòu)皮瓣是Yao[1]在1982年首先提出來的，根據(jù)受區(qū)需要，通過血管載體植入的方式，在不含軸型血管的區(qū)域構(gòu)建出可帶血供轉(zhuǎn)移的組織瓣。但是，其血供范圍難以預(yù)計(jì)，可能會(huì)出現(xiàn)不可預(yù)料的部分壞死，尤其是皮瓣遠(yuǎn)端。而再血管化不充分是造成預(yù)構(gòu)皮瓣遠(yuǎn)端壞死的主要原因，因此，預(yù)構(gòu)皮瓣壞死的防治及機(jī)制研究已逐漸成為整形外科醫(yī)生研究的熱點(diǎn)問題。目前的理論認(rèn)為皮瓣再血管化的形成存在兩種不同的途徑：一是血管形成，由已存在的血管通過出芽的方式形成廣泛的微血管；二是血管生成，由缺血部位的細(xì)胞分化而來[2]。依照這兩種機(jī)制，學(xué)者們采用促血管形成的生長因子（治療性血管形成）和細(xì)胞移植（治療性血管生成）來加速預(yù)構(gòu)皮瓣的再血管化進(jìn)程。

1生長因子療法促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣再血管化

生長因子/細(xì)胞因子能夠直接或間接加速血管的形成，許多學(xué)者采用促血管形成的生長因子，如:血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor beta ，TGF-β）、血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）來促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的再血管化。Iwasawa[3]將膠原作為TGF-β的載體置于血管束和皮膚之間，結(jié)果證實(shí)TGF-β可以縮短兔預(yù)構(gòu)皮瓣再血管化的時(shí)間。Haws等[4]在豬的預(yù)構(gòu)背闊肌皮瓣中，將攜帶bFGF的明膠海綿置于肌肉與皮下之間，術(shù)后微血管造影顯示bFGF治療組血管分支形成明顯增多；與對(duì)照組相比，bFGF治療組皮瓣幾乎未發(fā)生壞死，這說明bFGF可以增加皮瓣存活和血管生成，促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣成熟；而Hijjawi等[5]用Ⅰ型膠原包被的PDGF-B/ FGF2質(zhì)粒DNA來改善大鼠橫行腹直肌皮瓣的缺血狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDGF-B能夠明顯改善皮瓣存活情況而FGF2卻不能，不過FGF2也促進(jìn)了毛細(xì)血管網(wǎng)的形成，只是不夠充分而已，這可能與蛋白的生物活性水平有關(guān)。國內(nèi)李青峰等[6]應(yīng)用重組人VEGF來促進(jìn)由鼠尾血管束預(yù)構(gòu)的大鼠下腹部預(yù)構(gòu)皮瓣中新生血管的形成，結(jié)果證實(shí)術(shù)后5周VEGF組皮瓣存活面積較對(duì)照組有明顯提高，實(shí)驗(yàn)中作者將VEGF和聚乙烯醇（PVA）混合應(yīng)用避免其流失，皮瓣存活并沒有因?yàn)閼?yīng)用PVA而得到改善。黃晨昱等[7]用生物蛋白膠作為VEGF/bFGF載體及緩釋體來促進(jìn)兔預(yù)構(gòu)擴(kuò)張皮瓣的形成，結(jié)果卻表明用生物蛋白膠承載生長因子優(yōu)于直接應(yīng)用，并且在改善皮瓣血流方面，VEGF起效快，作用強(qiáng)，時(shí)間短；bFGF起效慢，作用持久，不過兩者均能通過刺激細(xì)胞增殖和減少凋亡來促進(jìn)血管新生和預(yù)構(gòu)擴(kuò)張皮瓣成熟。應(yīng)用緩釋技術(shù)可以延長生長因子的作用時(shí)間，缺點(diǎn)是需要的蛋白量大。近年來主要是通過基因治療技術(shù)來延緩它的釋放。Gurunluoglu[8]將腺病毒介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子(Ad-VEGF) 局部皮下注射于預(yù)構(gòu)的大鼠腹部島狀皮瓣的血管蒂周圍，與其他兩組相比， Ad-VEGF治療組預(yù)構(gòu)皮瓣的存活面積顯著性提高，雖然不能對(duì)形成的血管進(jìn)行定量分析，可是微血管造影顯示Ad-VEGF治療組血管蒂周圍新生血管明顯增多。丁志等[9]將腺病毒-VEGF基因重組體皮下注射于大鼠腹部預(yù)構(gòu)皮瓣植入血管蒂周圍，結(jié)果證實(shí)植入血管周圍新生血管豐富，以毛細(xì)血管為主，這說明腺病毒-VEGF基因重組體能通過促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣的血管新生，增加預(yù)構(gòu)皮瓣的存活率。

以上研究證實(shí)生長因子的應(yīng)用使主動(dòng)刺激血管新生成為可能。目前普遍認(rèn)為在這些生長因子中，VEGF是一種最重要的血管生成因子，能特異性結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞受體并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長，增加細(xì)胞的通透性，促進(jìn)其有絲分裂，由于VEGF半衰期短，約是30～45min，缺血環(huán)境下可延長到6～8h[6]，因此，不能持續(xù)發(fā)揮作用，此外價(jià)格昂貴也限制了其應(yīng)用，并且外源性細(xì)胞因子作用的發(fā)揮還受到內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的限制，基因治療具有使機(jī)體感染病毒的危險(xiǎn)。因此，無論是局部應(yīng)用血管生長因子還是給予基因治療都不能既沒有明顯的副作用又能取得良好的效果。血管生長和組織再生是復(fù)雜的、多基因活動(dòng)，在不同時(shí)間可能需要多種生長因子的參與[10]。許多學(xué)者還認(rèn)為若只給予單一的細(xì)胞因子或生長因子不可能產(chǎn)生明顯的臨床效果[11]。

2細(xì)胞療法促進(jìn)預(yù)構(gòu)皮瓣再血管化

細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展開辟了醫(yī)學(xué)發(fā)展的新時(shí)代，干細(xì)胞已成為當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。再生醫(yī)學(xué)和整形外科主要用于修復(fù)或替代人體已缺失、受損或老化的細(xì)胞，并重建它們的功能[4]。這個(gè)過程主要取決于受損或缺失組織的血管化程度，血管形成卻限制了再生醫(yī)學(xué)和整形外科的發(fā)展，并且它決定著皮瓣或皮片的存活。單一的細(xì)胞因子或生長激素不足以調(diào)控血管化這一復(fù)雜級(jí)聯(lián)過程。細(xì)胞移植被認(rèn)為是對(duì)局部環(huán)境進(jìn)行長期調(diào)控的最佳方法之一，干細(xì)胞能夠促進(jìn)缺血組織包括皮瓣的血管形成已經(jīng)得到證實(shí)。

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived stem cells， BMSCs）：BMSCs來源方便，分離培養(yǎng)容易，具有自我更新和多向分化能力。對(duì)各類缺血性疾病具有一定的治療效果。BMSCs用于心肌缺血的治療，可以減少缺血壞死面積，增加缺血區(qū)毛細(xì)血管數(shù)量，改善心肌功能[12]。Fu 等[13]認(rèn)為BMSCs可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的修復(fù)。鄭巖等[14]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染VEGF用于大鼠缺血皮瓣，能夠促進(jìn)皮瓣的成活。然而，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力隨供體年齡的增加而顯著降低[15]。

2.2內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）：1997年，Asahara[2]分離并證實(shí)人類出生后的外周循環(huán)血液中存在著能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的EPCs。EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，來源于骨髓，循環(huán)于外周血中，對(duì)缺血組織具有趨向性，能參與局部新生血管的形成[16]，促進(jìn)缺血部位的再血管化。研究證實(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞在腫瘤生長[17]、心肌再生[18]和治療腦缺血疾病[19]方面發(fā)揮了重要作用。2004，Park[16]首先報(bào)道了內(nèi)皮祖細(xì)胞可以增加裸鼠背部隨意型皮瓣的毛細(xì)血管密度，提高其存活面積。Zan等[20]將EPCs皮下注射至大鼠預(yù)構(gòu)皮瓣植入的血管蒂周圍，7天后預(yù)構(gòu)皮瓣的存活面積顯著增加，毛細(xì)血管密度明顯提高，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)預(yù)構(gòu)皮瓣中存在DiI標(biāo)記的EPCs，并且細(xì)胞能夠表達(dá)vWF因子。實(shí)驗(yàn)證明局部植入EPCs可以提高預(yù)構(gòu)皮瓣的存活率，在促進(jìn)新生血管形成方面，內(nèi)皮祖細(xì)胞要優(yōu)于VEGF。只是內(nèi)皮祖細(xì)胞來源有限，與大多成體干細(xì)胞相比，其體外增殖能力相對(duì)較弱，限制了其廣泛應(yīng)用。

2.3脂肪來源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）：Zuk等[21]發(fā)現(xiàn)脂肪組織中存在間充質(zhì)干細(xì)胞，稱為脂肪干細(xì)胞，具有多向分化能力。在整形外科，脂肪組織可以大量獲得并且不會(huì)造成供區(qū)的損傷，如果能夠從吸脂術(shù)的多余脂肪組織中提取出ADSCs，來用于促進(jìn)組織再生和血管化，將起到“變廢為寶”的效果，ADSCs有望成為一新的種子細(xì)胞來源。2004年，有文章報(bào)道脂肪干細(xì)胞可以挽救小鼠的下肢缺血[22]。魯峰等[23] 將轉(zhuǎn)染VEGF的ADSCs用于自體脂肪移植，結(jié)果證實(shí)ADSCs可以作為載體使VEGF不斷釋放，并且與未轉(zhuǎn)染的ADSCs相比，轉(zhuǎn)染的ADSCs能分泌更多的VEGF，增加毛細(xì)血管密度和脂肪的活力；他們還證實(shí)ADSCs局部注射能夠顯著提高大鼠隨意型皮瓣的活力，組織學(xué)檢測(cè)證實(shí)隨意型皮瓣中毛細(xì)血管密度顯著增加，并且免疫熒光可以檢測(cè)到由DiI標(biāo)記的ADSCs分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞，但是該實(shí)驗(yàn)并未檢測(cè)DiI標(biāo)記的ADSCs能否分泌VEGF等血管生長因子[24]。Li等[25] 將ADSCs注射至大鼠預(yù)構(gòu)皮瓣植入的血管蒂周圍，術(shù)后檢測(cè)證實(shí)預(yù)構(gòu)皮瓣的存活面積和新生毛細(xì)血管數(shù)量顯著增加，ELISA檢測(cè)在細(xì)胞植入后7天內(nèi)，ADSCs組預(yù)構(gòu)皮瓣VEGF-A蛋白水平隨時(shí)間延長是逐漸增加的，這種趨勢(shì)在PBS空白對(duì)照組并未出現(xiàn)，軟骨細(xì)胞組呈現(xiàn)輕微降低的趨勢(shì)，說明ADSCs能夠分泌生長因子來促進(jìn)血管的形成，但是作者并未對(duì)植入的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記以證實(shí)新生內(nèi)皮細(xì)胞是否來源于ADSCs。我們課題組在脂肪干細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和皮瓣存活方面也做了大量工作。我們將ADSCs用于大鼠受損創(chuàng)面，結(jié)果證實(shí)ADSCs可以分化為上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，并能分泌VEGF、HGF、FGF2等生長因子來加速組織上皮化和肉芽組織沉積，并且能夠促進(jìn)新生血管形成，免疫熒光檢測(cè)證實(shí)GFP標(biāo)記的ADSCs可以分化為CD31陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞[26]。我們還用ADSCs復(fù)合bFGF來促進(jìn)大鼠腹壁成形術(shù)后TRAM皮瓣的成活，結(jié)果證實(shí)ADSC-bFGF 能刺激TRAM皮瓣的血管新生和增加血管數(shù)量，從而提高皮瓣的存活率[27]。ADSCs具有與BMSCs相同的分化和增殖能力，是促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和缺血組織包括皮瓣血管形成的理想細(xì)胞來源。

預(yù)構(gòu)皮瓣已成為治療復(fù)雜的畸形和缺損，尤其是顏面部畸形缺損的理想手段，但是如何有效縮短血管化進(jìn)程、誘導(dǎo)血管新生是有待解決的問題。生長因子療法普遍認(rèn)為具有起效速度快，量效曲線穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也存在著諸如無法形成結(jié)構(gòu)功能完整血管、半衰期短等缺點(diǎn)。基因治療存在著感染病毒的危險(xiǎn)。細(xì)胞治療已證實(shí)能夠促進(jìn)新生血管的形成，細(xì)胞最佳植入方法和時(shí)間問題以及植入細(xì)胞是通過何種機(jī)制來調(diào)控血管形成這一復(fù)雜過程是今后進(jìn)一步的研究方向。

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[收稿日期]2011-01-29 [修回日期]2010-03-30

編輯/李陽利