綠色熒光標記共培養睪丸體細胞體內\\外培養觀察

[摘要]目的：對Wistar大鼠睪丸間質體細胞轉染攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒，為進一步標記睪丸間質體細胞移植組織工程實驗奠定基礎。方法：獲取Wistar大鼠睪丸間質體細胞，用慢病毒轉載綠色熒光對其轉染標記，體外培養，在共聚焦熒光顯微鏡下動態觀察細胞生長、增殖等情況。回植于去勢鼠體內，培養一定時期后取心臟血進行雄激素的檢測。結果：睪丸間質體細胞于90h后，在熒光顯微鏡藍光激發波長下，可發出明亮的綠色熒光，轉染率達80%。傳代后的細胞仍能發出明亮的綠色熒光。回植后血清學檢測有明顯高于對照組的激素檢出。結論：經GFP轉染后的睪丸間質體細胞仍具有睪丸間質體細胞的特性。采用攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒標記睪丸體細胞中梭形及不規則形細胞（SLCs等）轉染細胞效率高且持久、簡便有效，且能保持睪丸間質體細胞原有生物學特性。

[關鍵詞]綠色熒光；共培養睪丸體細胞；細胞標記

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）04-0608-05

Detection of the culture in vitro of the co-cultured testis somatic cells and GFP labeling

LI Ming1，XU Feng2，XU Hong-xia1，WANG Xiao-yun3，FAN Xing4，BI Hong-da3，XING Xin3

(1.Department of Plastic Surgery， Navy General Hospital，Beijing100037，China;2.Nuclear of Shanghai Ninth People's Hospital Affiliated Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200011，China;3.Department of Plastic Surgery，Changhai Hospital Affiliated The Second Military Medical University Shanghai 200433，China;4. The Institute of Plastic Surgery，PLA of The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveGreen fluorescent protein(GFP) are nanoparticles which have strong fluorescence intensity and more are resistant to photobleaching thanorganic fluorescence probes in cell biology and biomedicine. In this report， we labeled it with GFP for the co-cultured testis somatic cells.MethodsWe got seed-cells labeling with GFP. We cultured the labeled cells and went down to the future generation. We observed it by the micrscope. Assay the serum testeosterone level of the transplanted rats by heart puncture.ResultsThe co-cultured testis somatic cells labeled with GFP were easy to label. The GFP in the cells were brighter， more stable. The GFP in the cells were inherited by the daughter cells. Conclusion GFP labeling opened up new possibilities for monitoring of the co-cultured testis somatic cells. Especially for stem Leydig cells， SLC， Progenitor Leydig cells， PLC. And can remain its proper biological characteristics

Key words: green fluorescent protein (GFP); the co-cultured testis somatic cells; cell labeling

新興的組織工程技術為組織、器官缺損及激素分泌下降等方面的患者帶來了希望和福音。組織工程技術，其基本原理是將少量種子細胞經體外擴增后與生物載體結合，在體內或體外構建具有一定形態和生理功能的組織甚至器官。要了解作為種子細胞的睪丸間質體細胞移植后在體內的生物學行為（如遷移定植、分布、增殖、分化和激素的分泌等），離不開睪丸間質體細胞的示蹤和定量技術。傳統的標記方法隨著標記時間的延長和細胞分裂次數的增加，標記物會逐漸減弱甚至消失，不利于移植細胞的示蹤和細胞分化的研究。綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein)在紫外光或藍光激發光下可自發地發射內部綠色熒光，在普通顯微鏡下即可觀察出[1-2]。綠色熒光蛋白標記具有表達穩定、方便檢測及不影響細胞功能等優點。從而被廣泛地應用于示蹤移植干細胞在體內的定植、分布、含量、分化及轉歸等方面的研究[3-4]。在前期研究中，依據Leydig細胞貼壁迅速的特性建立了一種簡易快速的Leydig細胞分離技術[5]。后又經研究用差速貼壁法獲取睪丸間質細胞。近期有研究表明經差速貼壁法獲得的睪丸間質體細胞群中含有Leydig干細胞（Stem Leydig cells，SLCs）、前體細胞（Progenitor Leydig cells， PLC）及成熟的Leydig細胞，前體細胞向LC定向分化后，開始特征性表達3β-羥類固醇脫氫酶（3β-HSD），但其增殖能力逐漸降低，至成熟LC時已完全喪失有絲分裂能力。因此，干細胞和前體細胞是成熟LC生理性更新的重要來源[6-9]。使得睪丸間質體細胞具有激素分泌及分化潛能，SLCs在體外培養過程中逐漸分化成成熟Leydig細胞，實現激素可持續性分泌[10]。是雄激素分泌組織工程構建的理想種子細胞。本實驗通過攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒轉染睪丸間質體細胞，為進一步標記睪丸間質體細胞移植組織工程實驗奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料及試劑

1.1.1實驗動物：3周齡、體重50～56g雄性近交系同基因wistar大鼠，中國科學院上海實驗動物中心提供。

1.1.2試劑和藥品：DMEM/F12(1:1)購自Gibco公司；胎牛血清（FCS）購自（美國，Hyclone）；攜帶GFP的慢病毒(第二軍醫大學長海醫院朱吉博士惠贈)；胰蛋白酶、胎牛血清等其它化學用品(購自美國Sigma公司)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)；CO2孵箱 (美國，Forma)。

1.2細胞的培養及GFP標記

1.2.1 Wistar大鼠睪丸間質體細胞的分離及培養：無菌條件下切取3周齡wistar大鼠的睪丸組織，去除白膜，和可見血管，將睪丸組織剪碎，0.3%復合膠原酶NB4與組織量按5:1比例，于37℃恒溫搖床內消化至睪丸形狀基本消失，曲細精管斷裂，加兩倍量的PBS稀釋。經150目濾網過濾，1 500r/min離心5min，沉淀細胞，37℃、5%CO2、95%O2和100%濕度條件下，無血清DMEM/F12(1:1)培養24h，沖洗去除懸浮細胞，所得全部貼壁細胞即為共培養睪丸體細胞。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態與生長情況。待細胞長滿培養皿底，即可用0.25%胰蛋白酶消化，注意控制消化時間不超過2min，接著進行傳代。

1.2.2 Wistar大鼠睪丸間質體細胞的GFP轉染即慢病毒GFP轉染睪丸間質體細胞：將培養的睪丸體細胞以0.25%胰酶蛋白酶-0.02%EDTA消化，制備單細胞懸液。將病毒液小心滴加之細胞上，輕輕混勻。置于37℃，5% CO2、95%O2和100%濕度培養箱中孵育4h，離心，棄去轉染液，將細胞按2.5×106的密度進行接種于經0.1%明膠包被的新培養皿內，加2ml加有血清DMEM/F12(1:1)培養基繼續培養48～90h。熒光倒置顯微鏡觀察、拍照，常規培養、傳代。

1.3標記后的睪丸間質體細胞回植：將轉染標記好的睪丸間質共培養細胞復合于生物材料支架上回植于去勢鼠（事先制備并飼養一定周期）體內，進行一定時間的體內培養。

1.4 雄激素的檢測：抽取回植了轉染了GFP的睪丸間質體細胞的去勢鼠的血液，離心后取用血清，經Access全自動免疫分析系統(RIA，微粒子發光原理)(Beckman C0ulter，USA)測定睪酮水平。

2結果

2.1 Wistar大鼠睪丸間質體細胞的GFP轉染：原代培養的睪丸間質細胞中LC呈長梭形或是圓形，核大，胞質少，類似石榴籽狀。SC呈長柱狀或三角形，有突起，折光性強。LC干細胞呈紡錘形、梭形或不規則形；慢病毒轉染后的共培養睪丸間質細胞中成熟的LC逐漸減少，反之梭形、不規則形，中間折光性強的細胞比例相對增大(圖3)。選擇激發波長為488nm、發射波長507nm熒光顯微鏡下，GFP轉染48h、72h、90h后的共培養睪丸間質細胞中的干細胞均貼壁生長良好，折光性好，呈紡錘型、梭型或不規則形，細胞膜光滑完整，胞質豐富，核輪廓清晰，細胞增殖速度無明顯改變；而圓形，核大，胞質少，類似石榴籽狀的LC細胞進一步減少，崩解。熒光顯微鏡下，轉染48h可觀察到熒光表達，但強度稍弱（圖2）；72h后熒光顯微鏡下可見細胞呈貼壁狀態，開始發出較強的翠綠色熒光（圖4）。90h后大多數細胞發出明顯綠色熒光，呈“全細胞型”，即胞質和胞核彌漫性分布，表達強者，熒光呈翠綠色，有的區域可見數個聚集在一起的熒光細胞(圖5)。傳代后仍然是以梭形及不規則形細胞貼壁生長良好，而圓形類石榴籽狀細胞較少且不健康，要么處于凋亡中（圖6）。未轉染GFP的對照組細胞未見綠色熒光。收集轉染標記好的睪丸間質共培養細胞復合于生物材料支架上，細胞濃集后發出翠綠色熒光，可間接通過回植時散落的細胞團觀察(圖7)。

2.2 Wistar大鼠睪丸間質體細胞的轉染效率：隨機計數4個低倍視野中顯微鏡及轉換熒光觀察的同一視野中的細胞數量，計算90h熒光轉染效率為80%。

2.3標記后的睪丸間質體細胞回植：回植后實驗鼠成活良好，進食、睡眠等如常，未觀察到死亡或其它異常行為。

2.4 血清學檢測：血清學檢測仍有明顯高于空白對照回植的雄激素表達。

3討論

3.1 GFP基因轉染睪丸間質體細胞的示蹤作用：GFP是從水母中分離出來的一種具有自發熒光的小分子蛋白質[11]，具有性質穩定、易于構建融合蛋白且融合蛋白仍能保持熒光活性、易于檢測、檢出率高和無細胞毒性等優點。因此已成為檢測體內基因表達及失蹤完整活細胞生命現象的重要標記物，在生物醫學領域應用日益廣泛[12]。本實驗希望用GFP標記目的細胞--睪丸間質體細胞。前期實驗證明睪丸間質體細胞共培養能提供一個由細胞外基質、細胞因子及細胞間的相互接觸形成的穩定的組織微環境，這對發育階段Leydig細胞數量和功能維持都具有重要支持和調節作用[13]，而成熟Leydig細胞分泌雄激素是主要的功能細胞。許多研究證實，成熟的LC為終末分化細胞，不具備有絲分裂能力，其在體數量的維持主要依靠LC的干細胞（stem Leydig cells， SLC）及前體細胞（Progenitor Leydig cells， PLC）[6-9]。并且有實驗證明差速貼壁法獲得的7天齡、3周齡大鼠睪丸間質細胞群中均含有Leydig干細胞（Stem Leydig cells，SLCs）SLCs在體外培養過程中逐漸分化，表達3β-羥基類固醇脫氫酶，并產生睪酮[10]。睪丸間質體細胞群中含有Leydig干細胞（Stem Leydig cells，SLCs）及成熟的Leydig細胞，使得睪丸間質體細胞具有激素分泌及分化潛能，SLCs在體外培養過程中逐漸分化成成熟Leydig細胞，實現激素可持續性分泌。對于構建一塊能回植于體內、可持續地分泌雄激素的組織來說意義深遠。為此，本實驗應用慢病毒介導將GFP基因轉染睪丸間質體細胞，使其攜帶示蹤標記。并將標記好的細胞附著于一定材料的復合物上回植于事先制備好并培養一定時期的去勢鼠體內。通過檢測其生物學特性、轉染率以便了解其轉染后的功能與轉歸。標記成功與否以細胞是否發出翠綠色熒光為準，同期通過空白對照排除其它因素引出的非轉染造成的熒光。收集轉染GFP基因的睪丸間質細胞回植入體內時培養皿散落的細胞團，可見翠綠色細胞團，由于細胞團呈立體球形，鏡下只能清晰地看到某一層面的細胞。其余模糊的綠色也是轉染GFP的細胞，說明經過收集、離心等過程的操作，轉染后的細胞性能穩定，仍具較強的綠色熒光。更進一步說明回植入體內的細胞為標記綠色熒光后的大鼠睪丸間質共培養細胞。激素檢測轉染GFP后的睪丸間質體細胞回植鼠的血清，有明顯高于對照組的激素檢出，說明經GFP轉染后的睪丸間質體細胞仍具有睪丸間質體細胞的特性，GFP基因并未影響其中相關細胞激素的分泌。而在GFP轉染睪丸間質體細胞結果說明說明在睪丸間質體細胞中的梭形細胞（SLCs等）轉染細胞效率高且持久。但對于鋪展開的呈石榴籽狀的細胞即成熟的LC則不能標記，且有使細胞崩解，凋亡的作用。

3.2 本實驗中慢病毒載體的優、缺點：本實驗以原代培養的睪丸間質體細胞作為靶細胞進行轉基因標記研究，采用慢病毒載體實現了外源性基因的轉染，提示GFP基因已經轉染到睪丸間質體細胞內，并有效表達。實驗觀察到GFP成功轉染的細胞多為梭形的未完全分化成熟的細胞，而成熟的鋪展開的呈石榴籽狀的細胞則崩解，凋亡。我們將標記好GFP的種子細胞回植于體內，回植后實驗鼠成活良好，進食、睡眠等如常，未觀察到死亡或其它異常行為，從血清學檢測中發現有高于空白對照組的激素分泌。說明，慢病毒載體在某種程度上會損傷發育成熟的睪丸間質細胞，但對未發育成熟的細胞不但不影響它的分化、還能成功標記。我們使用GFP作為標記基因，相應的編碼蛋白能在熒光顯微鏡下顯示特異性的熒光，由此作為確定基因轉染成功與否的根據。所以相對其他標記研究方法，本實驗操作更簡便，一旦標記成功性狀穩定，更能直觀的觀察實驗結果。但存在選擇性標記（成熟的睪丸細胞無法標記）、標記過程相對較慢，因為基因轉染后，蛋白的表達仍需時間。慢病毒GFP轉染有一定細胞毒作用，不適用于成熟的有分泌功能的LC，但適用于梭形SLCs，且回植后不影響它的分化及之后的激素分泌。可采用一定方法將成熟LC及梭形SLCs分開，將篩選出的類干細胞及前體細胞進行綠色熒光標記，對成熟的LC以量子點標記，標記成功后將其混合共培養，再回植，既不影響成熟LC生長、分泌，又能在體內檢測相應細胞的轉歸。或者篩選出類干細胞及前體細胞進行綠色熒光標記，標記成功后誘導并促其向成熟細胞發育，然后回植于體內培養，希望可以達到體內長期存留標記細胞的作用。甚至我們可以利用慢病毒GFP轉染的細胞毒作用，使其天然的破壞成熟細胞而僅僅留下類干細胞及前體細胞并標記，去進行此類別更細化的細胞的相關研究。轉染圍繞慢病毒展開基因標記，仍有許多問題有待研究，如慢病毒的毒性作用、轉歸，對宿主細胞的影響。等具體細節問題需要進一步認識后方能廣泛地應用。

[參考文獻]

[1]Shimomura 0，Johnson FH，Saiga Y．Extraction，purification and properties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminous hydromednsan，Aequorea[J].J Cell Comp Physiol，1962，59:223-239.

[2]Prasher DC，Eckenrode VK，Ward WW，et a1．Primary structure of th eAequorea victoria green-fluorescent protein[J]. Gene，l992，l11(2)：229-233.

[3]關云謙，陳彪，劉平，等．干細胞腦內移植有效標記研究：綠色熒光蛋白質粒標記的應用價值[J].中國臨床康復，2004，8(13):2506-2508．

[4]宗兆文，程天民，粟永萍，等．增強型綠色熒光蛋白腺病毒表達載體構建及在移植干細胞示蹤和定量中的初步應用[J].中國臨床康復，2006，10(21):10-12．

[5]王曉云，邢新，周廣東．簡易快速獲得大量高純度大鼠Leydig細胞[J].中華泌尿外科雜志，2007，28:86-90．

[6]Ge RS，Dong Q，Sottas CM，et al. In search of rat stem Leydig cells: Identification， isolation，and lineage-specific development[J].PNAS，2006，103(8):2719-2724.

[7]Lo KC，Lei Z，Rao ChV， et al. De novo testosterone production in luteinizing hormone receptor knockout mice after transplantation of leydig stem cells[J].Endocrinology，2004，145(9):4011-4015.

[8]Davidoff MS，Middendorff R，Enikolopov G，et al.Progenitor cells of the testosterone-producing Leydig cells revealed[J].JCB，2004，167(5): 935-944.

[9]Ge RS，Dong Q，Sottas CM，et al. Gene expression in rat leydig cells during development from the progenitor to adult stage:a cluster analysis[J].Biol Reprod，2005，72(6):1405-1415.

[10]畢宏達，王曉云，周廣東，等.大鼠睪丸間質細胞體外培養不同時間3p一羥基類固醇脫氫酶的表達[J].組織工程與重建外科雜志，2009，5(1):7-11.

[11]Shimomura O．The discovery of aequorin and green fluorescent protein[J].J Microsc，2005，217(Pt1):1-15．

[12]Shaner NC，Steinbach PA，Tsien RY．A guide to choosing fluorescent proteins[J].Nat Methods，2005，2(12):905-909.

[13]王曉云，邢新，周廣東，等.共培養大鼠睪丸體細胞組織工程技術構建雄激素分泌組織[J].中華醫學雜志，2007，87(31):2223-2227.

[收稿日期]2010-11-26 [修回日期]2011-03-18

編輯/張惠娟