組織工程與整形外科的研究進展

隨著人口的增加，以治療疾病或替代損傷器官為主的生物醫學負擔仍然繼續加重。僅在美國，每年慢性疾病的醫療費用就超過1.5萬億美元，但其中的患者仍有70%死亡，每年有超過10萬余人等待器官移植[1]，其中主要原因就是生物材料缺乏和不足。利用組織工程材料修復和重建正常組織的缺損和畸形一直以來都是整形外科工作者感興趣的問題。現在人們不僅希望組織工程可以替換原器官，更期望可以恢復其生理功能，有關這方面的研究也在過去數十年得到了長足的進步[2]。本文則簡要概述組織工程在整形外科的應用，并對這一領域進行了展望。

1基本原則

“組織工程”一詞已經出現了二十多年，組織工程學是綜合應用工程學和生命科學的基本原理、基本理論、基本技術和基本方法，在體外預先構建一個有生物活性的假體，然后置入體內，修復組織缺損，替代組織、器官的部分或全部功能，或作為一種體外成分，暫時替代器官部分功能，達到提高生活質量，延長生命活動的目的[3]。盡管隨著生命科學的進步，組織工程得到了巨大進步，但Langer和Vacanti于1993年提出的組織工程中的三個基本方法至今仍具有現實意義[4]。

實施組織工程的主要過程包括：①通過組織活檢獲得種子細胞，并采用體外分離、培養、純化、擴增和傳代的方法，得到足夠數量的細胞；②將種子細胞接種到一種生物相容性良好的支架上，形成細胞支架復合物；③將復合物置入人體，使支架材料逐漸被機體降解吸收，而種子細胞增殖分化取代原有的組織器官。由此可見，足量種子細胞的獲取、支架材料的選擇及參與細胞增殖分化的誘導和調控的細胞因子的應用，便成為組織工程的三大主要環節。

1.1 種子細胞的獲取： 包括鑒別和分離出選定的具有增殖和修復、再生功能的細胞群。并采用體外分離、培養、純化、擴增和傳代的方法，得到足夠數量的細胞。組織工程使用的細胞多為干細胞，即具有全能性、可自我更新的細胞。目前，在人一生的各個階段和幾乎所有的成年組織都已經發現了干細胞的存在[5]。研究比較多的干細胞包括：

1.1.1 胚胎干細胞：是一些來源于囊胚內細胞團的細胞，具有最大潛能，可分化為三個胚層[6]。但對它的應用，卻因倫理道德、移植后的免疫原性等方面的問題而受到限制。

1.1.2 間充質干細胞：是可以分化成中胚層的多能祖細胞。可最終分化形成脂肪、骨、軟骨、肌肉和血管等組織[7]。組織重建時的祖細胞也大多來自這些組織中。

1.1.3 造血干細胞：可以分化產生血液系統中的各種細胞及參與血管形成的內皮祖細胞。

1.1.4 組織特異性干細胞：也已在皮膚、肌肉、心臟、腦等處發現。最近，研究人員已經利用基因誘導技術將成年人的細胞誘導成具有類似干細胞功能的多能細胞。而且對于這些“去分化”細胞的使用，不涉及倫理道德問題的限制。不過，這項新技術還需要更進一步的研究才能應用于臨床[8]。

1.2 細胞增殖分化的誘導和調控:干細胞的誘導分化需要在特定的化學環境和外界環境中才能實現，目前，對于分離細胞的生物化學環境控制的研究已經有了很大進展，調節細胞行為的許多生長因子和合成小分子的濃度、空間結構和時間相關性等都已經確定。納米粒子傳遞和控釋微球作為通過病毒性和非病毒載體的藥物運輸系統，和基因轉移已被用于概括組織形態發生發展的環境[9]。

1.3 支架材料:支架材料在組織工程研究中起著中心作用，隨著材料編織技術、生物力學技術、三維打印技術、影像學技術、計算機模擬技術以及生物反應器技術等各種現代技術的應用，它不僅為特定的細胞提供結構支撐，而且還起到模板作用，引導組織再生和控制組織結構[10]。作為組織工程支架材料，必須具有三維多孔性及足夠的孔隙率，以便給種子細胞的種植和初始分裂提供足夠的空間。除此之外，組織工程的支架材料需要給組織發生提供一個細胞外環境，如：良好的生物相容性、降解速率的可調控性和良好的可塑性等。目前的支架材料主要有天然的支架材料、人工合成的支架材料以及復合材料。不過，由于天然替代品有限，合成生物材料越來越多地被用于高分子可降解支架的制造[11]。

組織工程中的這三個元素也可以說是一種“種子和土壤”的關系，它包括了機械力、支架結構、細胞因子、氧張力等非細胞因素（即土壤）對干細胞、間質細胞和內皮細胞這些“種子”的影響。在組織、器官的生成過程中能夠充分培養一個再生的環境時需要良好的種子細胞和周圍環境。

2特定的組織工程

目前，國際上把組織工程產品大致分為四類：細胞類(如干細胞、治療性克隆、微囊化細胞治療)、代謝類(如生物人工肝、生物人工腎、生物人工胰腺)、結構類(如皮膚、心血管、骨骼肌)，以及其他類型。比較成熟的產品有組織工程皮膚，并在臨床獲得應用和組織工程軟骨。

2.1 皮膚:傳統的組織工程皮膚的制作方法是將角質形成細胞和/或成纖維細胞在天然或合成真皮支架上接種[4]。盡管根據這種方法已經制作出幾種商業化的組織工程皮膚，但他們的長期臨床效果一直因為沒有自身的祖細胞而欠佳。在毛囊、濾泡間細胞區域以及皮脂腺等處已發現存在許多皮膚干細胞，人們也已經認識到這些細胞對皮膚穩態的作用。基因治療也展示出對各種遺傳性皮膚病治療的可能，同時還可增加皮膚的再生能力[12]。近些年，已經利用人的脂肪干細胞生產出含有表皮、真皮、皮下組織的皮膚，并誘導出多能干細胞[13]。該研究說明，皮膚細胞組織可以分化成為各種組織類型。盡管取得了這些可喜的研究成果，但再生出具有完整功能的皮膚仍有很長的路要走。角質形成細胞和成纖維細胞之間的復雜旁分泌關系剛剛被人們認識，他們和許多其他皮膚的物質通過產生如機械感覺、體溫調節及色素生成等重要功能來維持皮膚的穩態[14]。同時，細胞外基質是如何通過復雜的機制調節皮膚細胞的活性而產生可替代的皮膚，還需要進一步研究。隨著日益多樣化的細胞群和生化信號研究，未來的組織工程皮膚很可能繼續采用在基質上種植種子的方法。雖然，在關于皮膚的物理功能方面研究取得了很多進展，但如何使皮膚產生眾多功能特性仍是組織工程學中令人感興趣的問題。

2.2 脂肪：目前用于軟組織重建的方法是自體組織移植和人造埋植劑，但是卻受到組織吸收、埋植劑破裂或攣縮等多種問題的限制[15]。然而，組織工程脂肪通過在具有生物相容性的支架上接種脂肪祖細胞解決了這些問題。由于成熟的脂肪細胞增殖能力有限，最常用的細胞為前脂肪細胞和來自供體的脂肪組織和骨髓中的間充質干細胞。脂肪抽吸術和皮下脂肪切取術均可獲取足夠量的脂肪顆粒懸液或脂肪組織。因其含有大量的脂肪干細胞而在未來有較好前景。

除了移植后不易建立血運，這一組織工程共同難題外，組織工程脂肪還面臨著外形和體積不穩定的困難[16]。這方面接種干細胞的支架顯示出良好的優勢，研究發現植入脂肪后可使其維持原形狀達4周[17]。將脂肪來源的干細胞添加到抽出的脂肪后再進行脂肪移植，可以提高在大鼠模型上的組織存活率和血液供應形成率，最近此技術用來以較少的劑量增加人類乳腺癌組織[18]。未來臨床應用的成功，將取決于精煉干細胞的獲取、分離技術和誘發脂肪的生物材料持久性的研究進展。而且，由于脂肪干細胞的含量多、來源廣、多能的特點，預計將有越來越多的脂肪干細胞用來重建和形成其他間葉組織，如骨骼、肌肉、軟骨等。此外，它易建立血運，可塑性強，使其在未來廣泛地用于構建更為復雜的多組織結構成為可能。

2.3 骨骼肌：除了普遍存在的細胞-基質的作用機制之外，組織工程肌肉還面臨著復雜的微電子機械系統和機械網狀結構的挑戰。直接注射供體的成肌細胞由于受多種限制而不能成功，最新的進展是將成肌細胞或肌干細胞接種到組織工程支架上，在支架上采用機械刺激和電刺激提高他們分化為肌細胞的潛能[19]，增加骨骼肌功能的復雜性。為了增加組織工程肌肉中血管形成，研究人員在體外使用成肌細胞、胚胎成纖維細胞、內皮細胞的多元化體系，使組織工程肌肉提前形成血管。然后將這種骨骼肌結構植入免疫缺陷的老鼠體內，其整合、存活和血運建立的結果均優于不含這三種細胞的對照組[20]。這也同樣說明，成肌細胞附著于支架上后在體內分化成為骨骼肌的效果優于直接將其注入體內。

2.4 軟骨:軟骨是一種缺乏血供并且有與生俱來的自我修復機制的特殊組織。成熟的軟骨細胞在體外增殖能力和表型可變性都受到限制，因此目前的軟骨組織工程戰略側重于利用間充質干細胞和軟骨祖細胞[21]。這兩種細胞均可使成纖維細胞脫分化，通過基因增強軟骨再生能力的實驗已處于臨床前階段[22]。在體外利用接種多種種子細胞的支架已開發出仿生軟骨結構，植入到免疫抑制的小鼠體內后發現形成新軟骨[23]。目前，第一個生物工程軟骨已經用于治療4例小耳畸形患者，從耳殘余部獲取軟骨細胞，在體外培養、傳代后植入下腹部，使其擴大、生長成熟。形成的軟骨組織在6個月后取出雕塑成耳的形狀，在術后2～5年隨訪過程中未出現組織吸收的現象[24]。

2.5 骨：盡管在組織工程骨的探索道路上有了很多嘗試，但是如何組合出最合適的種子細胞、支架材料和誘導信號以形成最好的組織工程骨還沒有解決。盡管許多細胞都表現出成骨潛能，如成骨細胞、間充質干細胞、脂肪干細胞、胚胎干細胞、骨骼細胞，但最有效的細胞類型仍然未知。最近，在一項關于成年和胎兒干細胞成骨能力對比的研究顯示，兩者在急性股骨損傷的裸鼠模型上成骨能力無明顯差異。另一組在體外的模型實驗中證明，成骨細胞植于支架之前可以被分化前期的間充質干細胞增強其分化作用[25]。此外，他們還報道了生物反應器系統的改良成果，強調了在促進骨形成時環境信號作用的重要性。

2001年，第1例自體骨髓來源的間充質干細胞用于修復大的骨缺陷之后，另一個小組報道了使用含骨質塊、骨形態發生蛋白7（BMP-7）和自體骨髓細胞的鈦支架采用二期手術方式修復了一個下頜骨缺損的病例[26]。將設計好的支架首先置入患者的背闊肌(來當做原位誘導成骨生物反應器）7周以后利用自由皮瓣來修補頜骨缺損。然而，大規模臨床研究前，還需要繼續調查確定最合適的細胞、支架、生物工程和分子信號的組合來獲得最佳的生物工程骨。

2.6 血管：血管移植在重建手術中經常被用到，用于重建的血管主要有以下幾種：①自體同源移植，這類材料經常因為供體不健康導致的病態而不可用，且費用昂貴；②人工材料移植，這類材料容易形成栓塞，生長潛力和耐久性都比較差。基于干細胞的應用已經被用在血管構造上，包括使用胚胎干細胞構造小口徑血管（直徑＜6mm）以及使用原始內皮細胞、間充質干細胞來依次構造內皮層和肌纖維層[27]。基于細胞層的血管設計實現了完全自體同源的三層式血管的構造，第1例生物工程血管用于構建1例4歲女孩肺動脈的臨床試驗中[28]。血管生物反應器很好地調控了血管生成中關鍵的機械信號和生理信號，同時在“連接動靜脈的腔室循環模型”的體外生物反應器中產生了血管化。另外，對于小口徑人造血管遠期通暢率不高的問題，我們科室正在嘗試用脂肪干細胞和血管內皮細胞在血流沖擊下制作小口徑血管來解決這個問題。

2.7 周圍神經:治療神經缺陷的替換選擇有自體同源移植（受限于供源稀少、供體不健康，易發神經瘤和供受體不匹配），異源移植（受限于免疫排異反應）以及非細胞材料移植（受限于再生延遲）。組織工程技術戰略有希望將原始神經細胞、生長因子和其他生物材料合成，產生一種可行的替代品[29]。遍布全身的神經細胞表現出良好的可塑性，而且使用Schwann細胞和間充質干細胞的治療方法已經在體外和動物試驗中取得了成功[30]。基因治療已經表現出較大成功的可能，通過促進神經因子的過表達，加強神經再生的方法，但是在功能恢復的持久改善和病毒介導載體的基因傳遞的長期結果還是未知的[31]。與其他復雜組織一樣，神經缺損的修復也需要結構和生化的信號精確協調，才能使神經的生長最終恢復功能。

3展望

一直以來，組織工程的組織和器官在整形外科領域發揮著不可或缺的角色。盡管在組織工程領域取得了很多進展，但應用于臨床仍然有很多困難。許多涉及材料學、生物學、醫學、生物力學的基本問題及基本現象還沒有搞清楚，例如：細胞在工程化基質中如何實現功能、干細胞來源的產業化、生物力學在組織構建過程中的具體作用及機理、細胞外基質化可降解的支架材料等。另外，大器官的重建也仍舊受到血供有限的限制。這些問題都值得整形外科的工作者去思考和探究。

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[收稿日期]2010-11-29 [修回日期]2011-02-16

編輯/李陽利