中波紫外線對HaCaT細胞增殖活性的影響

[摘要]目的：探討中波紫外線（UVB）對HaCaT細胞損傷的影響。方法：取對數生長期的HaCaT細胞，用0、30、60、90 mJ/cm2劑量的UVB照射后繼續培養0、24、48、72h，在倒置顯微鏡下觀察其形態學變化，用MTT法檢測UVB照射對細胞增殖活性的影響。結果：在30～60mJ/cm2的UVB輻射下，隨輻射劑量的增大，細胞的增值活性逐漸下降，而細胞的凋亡率逐漸增加，倒置相差顯微鏡從形態學上證實了細胞的凋亡改變。結論：UVB可誘導細胞凋亡，且呈劑量依賴性。

[關鍵詞]中波紫外線；輻射；HaCaT細胞；損傷

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）03-0419-03

Effect of HaCaT cells proliferation by Ultraviolet-B Radiation

CHEN Chen1，SHI Yu-jie2，JIANG Zhen-you1， YANG Jian2

（1.School of Medicine， Jinan University， Guangzhou 510632，Guangdong，China; 2.Department of Dermatology， th e Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510260， China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of damadge on HaCaT cells irradiated by Ultraviolet-B Radiation （UVB）(0、30、60、90mJ/cm2). MethodsThe dose- and time- dependent photodamage was observed by light microscopy. MTT assay was used to record cellular activity.Results The irradiation damage of HaCaT cells was dependent on the irradiated dosages (0、 30、60、90mJ/cm2). Conclusion UVB can induce damadge of HaCaT cells.

Key words: UVB; irradiation; HaCaT cells; damadge

皮膚是日光輻射直接作用的靶器官，紫外光按照波長的長短分為UVC(200～280nm)、UVB（280～315nm）、UVA（315～400nm），其中UVB是紫外光最少的一部分，雖然紫外光對人體是有益的，但大量的紫外光輻射，尤其是UVB，會對人體健康造成威脅[1]。筆者采用不同劑量的UVB對HaCaT細胞進行輻射，以MTT法檢測UVB照射對細胞增殖活性的影響，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化，現報道如下。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1人角質形成細胞（HaCaT細胞）購自中國典藏培養物保藏中心（武漢大學保藏中心），在DMEM培養基（Gibco，美國）中培養。胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）均購自美國Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.2主要儀器設備：紫外光源（UVB燈管）為北京電光源研究所產品（功率8W，波長305nm）。UVB紫外線輻照計購自北京師范大學光電儀器廠。流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產品。紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），CO2培養箱（Napco 5400，日本）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養、分組和照光處理：取HaCaT細胞培養于含有體積分數10%小牛血清的DMEM培養基中，于37℃、95%濕度及體積分數5% CO2條件下培養、傳代。取對數生長期的HaCaT細胞，經0.5%胰蛋白酶+0.03%EDTA消化后用含10%小牛血清的DMEM培養基以1×105個/ml細胞密度接種于96孔培養板中，當細胞融合80%以上且處于對數生長期，吸去各組培養細胞培養液，用PBS沖洗一次，并加入少量PBS覆蓋底面。用鋁箔紙做避光處理，解開需要處理的孔，用UVB進行照射，并以UVB輻射度監視器標定照射強度，UVB劑量=UVB輻射度×時間（s）。培養板距燈管15cm，輻射總劑量分別為0、30、60、90mJ/cm2，照射完畢后加入完全培養基繼續孵育至0h、24h、48h、72h。

1.2.2 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化：以劑量0、30、60、90mJ/cm2UVB輻射細胞，在照射后0h、24h、48h、72h以倒置顯微鏡觀察細胞損傷的形態變化。

1.2.3 MTT法測定HaCaT細胞增殖活性：將100μl密度為1×105 個/ml HaCaT細胞懸液接種于96孔內，經0、30、60、90mJ/cm2照射處理，每組6個復孔，繼之更換新鮮培養液，繼續培養12h，各孔加入MTT 10μl（濃度為5mg/ml），再孵育4h后棄去上清液，加入150μl二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩15min，于570nm波長測定每組吸光度（A）值，觀察各組細胞的增殖活性并繪制細胞生長曲線。

1.3 統計學方法：以SPSS13.0統計軟件對實驗數據進行t檢驗和單因素方差分析，當P﹤0.05時認為差異有統計學意義。

2結果

2.1 UVB光損傷的形態學觀察 未經照光處理的HaCaT細胞經過一段適應期貼壁后很快進入對數生長期，生長狀況良好，細胞呈典型上皮樣特征，呈鋪路石樣形態，高核漿比例，細胞排列緊密，輪廓清楚折光好。亞融合狀態的細胞接受不同劑量30、60、90mJ/cm2 UVB照射后24h受到不同程度的損傷，呈劑量依賴性，表現為細胞腫脹變圓、皺縮、細胞碎片增多，部分漂浮于培養液中。30mJ/cm2 UVB輻照后損傷變化最輕，細胞稍腫脹，部分脫落；60mJ/cm2 UVB輻照后細胞腫脹，部分壞死、脫落，部分細胞空泡變性、核固縮；90mJ/cm2 UVB輻照后細胞腫脹明顯，壞死、脫落較60mJ/cm2 UVB明顯（圖1）。當HaCaT細胞接收相同的輻射劑量30mJ/cm2 UVB照射后，繼續培養，分別在0h、24h、48h、72h時間點進行觀察，表現為細胞逐漸腫脹，出現核固縮，壞死，脫落（圖2）。

2.2不同劑量UVB 0、30、60、90mJ/cm2輻射HaCaT細胞24h后用MTT法測定HaCaT細胞增殖活性，經t檢驗，30、60、90mJ/cm2 UVB組與0 mJ/cm2 UVB組相比較，各組P＜0.001，差異有統計學意義（表1）。

2.3 30mJ/cm2 UVB輻射HaCaT細胞后分別在0h、24h、48h、72h時間點測定細胞增殖活性，未經照光的HaCaT細胞具有良好的細胞增殖能力核較高的細胞活性，MTT法檢測顯示對照組細胞活性隨培養時間的增加而迅速增殖生長；而照光組細胞在照光后24h、48h、72h，MTT檢測均顯示細胞活性較對照組為低（t=4.974，P=0.001；t=17.634，P=0.000；t=26.042，P=0.000），且在長達72h的觀察過程中，細胞活性并無明顯回升（圖3）。

3討論

不同的紫外線對人體皮膚損害作用不同，其中UVB比UVA具有更強的誘變性和致癌性[2]。本研究采用UVB光源，以HaCaT細胞為輻射細胞，進行光損傷方面的研究。結果顯示，不同劑量UVB對細胞的損傷呈劑量依賴性，劑量越大，對細胞的損傷越重，細胞增殖活性隨照射劑量增大而下降，表現為細胞逐漸變圓、皺縮，懸浮細胞增多，碎片增多。在形態上進一步證實了UVB可誘導HaCaT細胞的凋亡。實驗發現，在相同劑量的UVB輻射下繼續培養細胞，細胞增殖生長受抑制，而未照光對照組細胞生長狀況良好，很快進入對數生長期。30mJ/cm2的UVB照射劑量與Sittailo等建立UVB損傷模型時采用的計量相當[3]，此計量相當于海平面1～2min的日曬量，UVB到達地球表面時的輻射強度約為18～30mJ/cm2[4-6]。夏濟平等[7]發現，小劑量UVB輻照（210～420J/m2）能夠誘導角質形成細胞凋亡，而較大劑量（1 260J/m2）的UVB照射可直接導致HaCaT細胞壞死。我們的研究從體外初步觀察了UVB照射對HaCaT細胞的影響，中波紫外誘導表皮細胞凋亡的藥物調控值得進一步研究。

[參考文獻]

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[7]夏濟平，宋秀祖，畢志剛. 紫外線誘導角質形成細胞凋亡和表沒食子兒茶酚沒食子酸酯保護機理的探討[J].中華皮膚科雜志，2003，36(11):632-634.

[收稿日期]2010-10-29 [修回日期]2011-02-12

編輯/張惠娟