肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠背部超長(zhǎng)任意皮瓣存活率影響的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：探討肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠背部超長(zhǎng)任意皮瓣血管生成的作用及皮瓣存活率的影響。方法：建立大鼠背部超長(zhǎng)任意皮瓣8.0cm×2.0cm動(dòng)物模型，直接皮下注射50ng/ml肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子溶液，術(shù)后7天觀察皮瓣顏色、質(zhì)地、毛細(xì)血管回流、壞死范圍、切割皮瓣出血情況；計(jì)算皮瓣的存活面積；免疫組化染色后在顯微鏡下計(jì)算毛細(xì)血管平均密度。通過(guò)自身前后對(duì)照、與生理鹽水組對(duì)照，比較兩者的差異。結(jié)果：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子組皮瓣的存活率81.45%±2.74%，與對(duì)照組的42.82%±7.03%比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組毛細(xì)血管數(shù)分別為12.70±1.35、12.31±1.22，兩者差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）；實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組毛細(xì)血管數(shù)分別為39.67±4.83、21.50±1.87，兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)后毛細(xì)血管密度高于實(shí)驗(yàn)前，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子能促進(jìn)皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成，提高皮瓣的存活率。

[關(guān)鍵詞]肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；超長(zhǎng)任意皮瓣；血管內(nèi)皮細(xì)胞；存活率

[中圖分類號(hào)]R622[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2011）03-0430-04

Experimental study on effect of hepatocyte growth factor on the survival rate of random ultra-long skin flap on the rat back

WANG Jia-rui，LIU Da-en，NONG Qing-wen，LI Shun-tang，LIANG Kun-lan，LI Kai-tong

（Department of Burns and Plastic Surgery， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi，China）

Abstract： ObjectiveTo investigate the angiogenesis function of hepatocyte growth factor (HGF) to random ultra-long skin flap on the rat back and its effect on the survival rate of the skin flap.MethodsMaking a 8.0cm×2.0cm animal model from a random ultra-long skin flap on the rat back， injected directly with 50ng/ml HGF solution， after 7 days observing the color of the skin flap， texture， capillary return， necrotic area， bleeding condition of the cut flap etc.; Calculating the survival area of the flap; After immunity staining， counting blood capillary with a 400 optical microscope. Making results through comparing the disparity between the before-experimental flap and that of after--experiment.， And also comparing with the saline control group.ResultsComparing the survival rate (81.45%±2.74%) of the HGF skin flap with the control group (42.82%±7.03%)， the differences are statistically significant (P <0.05); before experiment， The quantity of capillary of the experimental group and the control group are respectively (12.70±1.35) and (12.31±1.22)， the difference between the two is of statistic significance (P>0.05); After experiment， the quantity of capillary of the experimental group and the control group are respectively （39.67±4.83) and (21.50±1.87)， The difference between the two is of statistic significance (P<0.05); After experiment， the number of capillary of the experimental group is higher than that before experiment， the difference is statistically significant (P<0.05).ConclusionHGF can promote the formation of the vascular endothelial cells in the flap and improve the survival rate of skin flaps.

Key words: hepatocyte growth factor (HGF)；random ultra-long skin flap； vascular endothelial cells；survival

皮瓣修復(fù)是創(chuàng)傷（燒傷）、整形外科常用的治療手段，傳統(tǒng)的任意皮瓣的長(zhǎng)寬之比為（2.0～1.5）∶1，超過(guò)此比例皮瓣遠(yuǎn)端常常會(huì)發(fā)生壞死導(dǎo)致手術(shù)失敗而需要再次手術(shù)，給病人及家屬帶來(lái)痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前臨床上常用丹參注射液、低分子右旋糖酐及前列腺素E1、罌粟堿等通過(guò)疏通微循環(huán)方式或增加皮瓣血流量的方式來(lái)增加皮瓣血供，但臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)均缺乏唯一特異性。因此，預(yù)防和治療皮瓣遠(yuǎn)端的壞死一直是皮瓣修復(fù)創(chuàng)面研究的熱點(diǎn)及有待于解決的難點(diǎn)。研究表明[1]肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF)是繼血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)后第三種能夠促新生血管生長(zhǎng)因子。Taniyama等[2]在體內(nèi)外試驗(yàn)研究均表明其促進(jìn)血管生成的活性比前兩者更強(qiáng)大。但既往對(duì)HGF的研究主要集中于在腫瘤組織中的表達(dá)及缺血性疾病的血管再生的研究，經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)，未見(jiàn)有關(guān)促進(jìn)皮瓣血管生成的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化染色后計(jì)算毛細(xì)血管密度、觀察皮瓣存活面積，探討HGF對(duì)大鼠背部任意皮瓣血管生成的作用及對(duì)皮瓣存活率的影響，為尋找預(yù)防和治療皮瓣遠(yuǎn)端壞死提供一種的新思路和新方法。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及器械：健康標(biāo)準(zhǔn)成年S-D大鼠，體重300～350g、雌雄不限（廣西醫(yī)科大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（美國(guó)PeproTech公司），鼠抗人單克隆CD+34抗體MAB-0034（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)技術(shù)有限公司），快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)技術(shù)有限公司），DAB顯色試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司）。顯微鏡及病理圖像分析儀DMR+Q550（德國(guó)LEICA公司），實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心及一附院完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HGF溶液的稀釋配制：?jiǎn)⒂们半x心，用Hanks液配制成2 000ng/ml的原液后分裝于10個(gè)分裝瓶中。加10%FBS溶液及Hanks液配制成50ng/ml貼上標(biāo)簽，在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2動(dòng)物模型制備及實(shí)驗(yàn)分組：健康標(biāo)準(zhǔn)成年S-D大鼠20只，體重300～350g，隨機(jī)分成A、B兩組，每組10只，A組：HGF；B組：生理鹽水組。10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉，將動(dòng)物俯臥位固定，背部用硫化鈉脫毛后溫水洗凈。于大鼠背正中掀起8.0cm×2.0cm任意皮瓣，其縱軸與大鼠脊柱平行，且以之為對(duì)稱軸，蒂位于雙側(cè)髂嵴連線上。在距離蒂部3.6cm、4.8cm、6.0cm處分別作為蒂部平行的直線，與順皮瓣長(zhǎng)軸的三等分線相交于六點(diǎn)，這六點(diǎn)為注射位點(diǎn)[3]。切開(kāi)皮膚及皮下，于筋膜淺層掀起皮瓣，結(jié)扎基底部活躍出血點(diǎn)。皮瓣掀起后即刻以1ml微量注射器于皮下進(jìn)針，A組皮瓣下每一注射位點(diǎn)給予50ng/ml HGF溶液0.5ml，B組皮瓣下每一注射位點(diǎn)給予生理鹽水0.5ml。4-0絲線將皮瓣原位間斷縫合。術(shù)后切口涂四環(huán)素軟膏，單籠喂養(yǎng)。所有手術(shù)均由同一人完成。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1術(shù)后大體觀察：觀察動(dòng)物術(shù)后的飲食、活動(dòng)及創(chuàng)面愈合情況。

1.3.2皮瓣大體觀察，存活率的檢測(cè)：術(shù)后7天處死大鼠，皮瓣存活區(qū)與壞死區(qū)已明確。皮瓣壞死標(biāo)準(zhǔn)：皮膚顏色變黑、組織回縮、彈性差、質(zhì)地變硬、切割組織不出血。用透明紙繪出皮瓣形狀及壞死皮瓣大小，將壞死區(qū)域涂成黑色，數(shù)碼相機(jī)拍照并輸入計(jì)算機(jī)，使用病理圖像分析儀DMR+Q550計(jì)算出壞死面積。存活面積=設(shè)計(jì)面積一壞死面積，按(存活面積/壞死面積)×100%計(jì)算出存活面積比。

1.3.3組織學(xué)觀察：術(shù)后7天，切取皮膚標(biāo)本(在存活區(qū)，距存活與壞死交界處0.5cm)，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光鏡200倍下觀察其組織學(xué)變化、毛細(xì)血管管腔情況。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行微血管分析：10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片；融蠟后用純二甲苯中浸泡；不同濃度酒精梯度水化后沖洗；3% H2O2甲醇溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧物酶的活性后沖洗；檸檬酸組織抗原修復(fù)液工作液高壓抗原修復(fù)；滴加鼠抗人單克隆CD+34抗體MAB-0034后4℃恒溫箱過(guò)夜；37℃復(fù)溫后沖洗；滴加即用型IgG抗體-HRP多聚體，室溫下孵育后沖洗；滴加新鮮配置的DBA顯色劑，控制染色后自來(lái)水沖洗，終止顯色反應(yīng)；蘇木素輕度復(fù)染后1%鹽酸酒精水化，自來(lái)水沖洗；PBS沖洗返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片。所有切片均按照試劑盒的要求在相同條件下染色。鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野，以單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞或成簇的血管內(nèi)皮細(xì)胞作為一個(gè)毛細(xì)血管，單個(gè)高倍鏡視野下微血管的數(shù)目，取其平均值。測(cè)出每個(gè)高倍鏡視野面積，并計(jì)算單位面積下微血管數(shù)目(個(gè)/mm2)，作為評(píng)價(jià)微血管密度的指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均用(x±s)表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組間比較采用完全隨機(jī)兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1術(shù)后大體觀察：大鼠到實(shí)驗(yàn)結(jié)束均存活，飲食、排便正常，沒(méi)有術(shù)后感染、化膿、體液滲出等不良反應(yīng)。

2.2皮瓣大體觀察：存活率的檢測(cè) A、B兩組皮瓣遠(yuǎn)端均出現(xiàn)不同程度的皮膚顏色變黑、質(zhì)地變硬、切割組織不出血，出現(xiàn)明顯的壞死跡象。A組皮瓣成活區(qū)域皮膚的顏色、彈性及質(zhì)地與正常皮膚組織更相似，壞死區(qū)域面積比B組少。A、B兩組皮瓣成活面積分別為(81.45%±2.74%)、(42.82%±7.03%)，兩組間皮瓣存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.192，P=0.000)。

2.3組織學(xué)觀察：術(shù)后7天，A、B兩組大鼠皮瓣均有毛細(xì)血管腔出現(xiàn)，真皮層內(nèi)有大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞。A組管腔數(shù)量明顯多于B組，且管腔的結(jié)構(gòu)好，管腔壁變薄富有彈性，管腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞。B組雖然有大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞存活，但呈現(xiàn)無(wú)序排列，紅細(xì)胞沉積較少（如圖1～3）。

2.4免疫組織化學(xué)染色分析：術(shù)前及術(shù)后7天兩組大鼠背部皮瓣CD+34免疫組織化學(xué)染色計(jì)算毛細(xì)血管的平均密度：A組分別為12.70±1.35、39.67±4.83；B組分別為12.31±1.22，21.50±1.87。實(shí)驗(yàn)前A組、B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.667，P=0.513)，實(shí)驗(yàn)后A組、B組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.100，P=0.000)，A組實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(t=16.253，t=0.000)，B組實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.992，t=0.000)。（如圖4～6）。

3討論

3.1 HGF是Michal Lopoulos等[4-5]在部分肝被切除后的大鼠血漿中發(fā)現(xiàn)能夠刺激肝細(xì)胞DNA合成的多肽因子，后經(jīng)提取純化并命名的一種具有多功能的間質(zhì)源性細(xì)胞因子。它是由分子量75kD的重鏈(亦稱α鏈)和分子量30kD的輕鏈(亦稱β鏈)通過(guò)二硫鍵構(gòu)成的二聚體。其主要來(lái)源于肝臟枯否氏細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、貯脂細(xì)胞、肺臟內(nèi)皮細(xì)胞以及惡性腫瘤細(xì)胞。

3.2 任意皮瓣移植后，其血運(yùn)主要靠蒂部的不知名的血管、真皮下血管網(wǎng)、筋膜血管網(wǎng)等周?chē)苁膫?cè)支供血，同時(shí)皮瓣遠(yuǎn)端的毛細(xì)血管的快速形成對(duì)預(yù)防及治療遠(yuǎn)端缺血也起重要的作用[6]。新生血管的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，首先血管擴(kuò)張及通透性增加，后經(jīng)過(guò)血管基底膜酶解，血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移、血管腔形成，周邊細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的作用等多個(gè)步驟協(xié)調(diào)有序地完成，最后形成新生血管網(wǎng)。國(guó)內(nèi)外在心臟缺血性動(dòng)物模型的研究[7-8]均表明HGF能夠促進(jìn)缺血性心肌的微小血管再生，增加內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量及心肌的血流量。黃瑤等[9]在體外培養(yǎng)牛的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證明HGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生和移行，且呈劑量依賴關(guān)系，當(dāng)加入HGF質(zhì)量濃度為100ng/ml時(shí)達(dá)到最大促血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和移行效果。其機(jī)制可能為：

3.2.1 HGF通過(guò)其受體c-met直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞移行、增生、生長(zhǎng)、產(chǎn)生蛋白酶、促進(jìn)組織侵襲和機(jī)化，內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)間隙擴(kuò)散，伸出胞漿芽并延長(zhǎng)，使毛細(xì)血管樣的導(dǎo)管形成。Nakamura等[10]在于大鼠血管的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的局部發(fā)現(xiàn)了HGF/c-Met系統(tǒng)。唐博[11]等有研究表明HGF通過(guò)促使血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，常染色質(zhì)增多。能有效地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程，細(xì)胞周期中S期、G2／M 期細(xì)胞增多，尤其能促使細(xì)胞進(jìn)入M期，這些都說(shuō)明HGF是一種強(qiáng)的有絲分裂原。

3.2.2 HGF可通過(guò)誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)而促進(jìn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，且二者具有協(xié)同作用。HGF可通過(guò)PI3激酶通路誘導(dǎo)VEGF的分泌和表達(dá)，從而間接促進(jìn)血管的生成[12]。由此，羅泊濤等[13]在研究鼻咽癌中HGF和VEGF的表達(dá)意義的結(jié)果時(shí)提出了通過(guò)抑制HGF靶分子表達(dá)和活性來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤血管生成，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的設(shè)想。

3.2.3 HGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)生、生存和再生，抑制細(xì)胞凋亡。周一軍等[14]通過(guò)HGF抑制糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)在體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞研究結(jié)果表明：HGF可顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，抗凋亡的bcl-2基因表達(dá)明顯升高，而促凋亡Bax基因表達(dá)無(wú)明顯變化，caspase-3活性顯著降低。Gopalkr Ishnapilla等[15]研究發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下HGF能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的程序性死亡，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞再修復(fù)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)采用直接皮下局部注射質(zhì)量濃度為50ng/ml，每只大鼠注射總量為150ng，術(shù)后7天皮瓣存活率HGF組（81.45%±2.74%）高于生理鹽水組的（42.82%±7.03%），減少皮瓣移植后遠(yuǎn)端的壞死；免疫組化染色計(jì)算毛細(xì)血管密度HGF組（39.67±4.83）高于生理鹽水對(duì)照組（21.50±1.87），促進(jìn)了皮瓣血管的生成。以上證據(jù)提示HGF可促使皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞再生、增生和新生血管的形成，減少皮瓣遠(yuǎn)端的壞死，提高皮瓣的成活率。其機(jī)制可能為HGF直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞移行、增生、生長(zhǎng)、產(chǎn)生蛋白酶、促進(jìn)組織侵襲和機(jī)化，內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)間隙擴(kuò)散，伸出胞漿芽并延長(zhǎng)，使毛細(xì)血管樣的導(dǎo)管形成，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

3.4 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HGF通過(guò)促進(jìn)皮瓣內(nèi)血管再生、新生血管形成，提高皮瓣的成存活率，具有一定的應(yīng)用前景。但該研究還處在初始階段，取得的資料及經(jīng)驗(yàn)還不多，如HGF的劑量、效應(yīng)時(shí)間、在體內(nèi)易被蛋白酶分解、半衰期短、局部一次使用生物學(xué)效應(yīng)不能充分發(fā)揮和遠(yuǎn)期安全性、分化的機(jī)制及新生血管的穩(wěn)定性缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，許多實(shí)際問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2010-11-09 [修回日期]2011-02-28

編輯/張惠娟