海參加工廢液中海參皂苷提取工藝的研究

摘 要:目的:研究和優(yōu)化從海參加工廢液中提取海參皂苷的工藝，為海參皂苷的規(guī)模化生產(chǎn)創(chuàng)造條件。方法:本文利用AB-8大孔樹脂從海參加工廢棄液中提取分離海參皂苷，并采用正交設(shè)計進(jìn)行了提取工藝條件的優(yōu)化。結(jié)果:經(jīng)研究和優(yōu)化確定了海參皂苷的最佳提取條件:海參廢棄液pH值為10、上樣速率為2倍柱體積(BV)/h、洗脫用乙醇濃度為70%、洗脫體積為6倍柱體積。性質(zhì)鑒定結(jié)果顯示，海參皂苷在Molish 反應(yīng)、泡沫實驗、沉淀實驗和Libermann-Burchard 反應(yīng)中均呈陽性，表明所得提取物確為皂苷;結(jié)論:本文確定了利用AB-8型大孔樹脂提取海參皂苷的最佳工藝，為海參皂苷的規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:海參海參皂苷 AB-8大孔樹脂 正交試驗

中圖分類號:R93文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1674-098X(2011)01(b)-0014-02

海參(sea cucumber)隸屬于棘皮動物門(Echinoermata)、游走亞門(Eleutherozoa)、海參綱(Holothuroidea)、盾手目(Aspidochirota)。全世界約有海參1100余種，其中可食用者有40余種。在我國，海參不僅一向被視為具有顯著滋補(bǔ)作用的美味佳肴，而且作為藥用的歷史也非常悠久，據(jù)查證，海參早在明代就被作為補(bǔ)益藥收入《食物本草》。

研究表明，海參中所富含的皂苷類物質(zhì)具有廣泛的生理學(xué)和藥理學(xué)活性，如抗真菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、提高免疫力等[1-3]。1969年，人類首次從海參中獲得了具有抗真菌活性的皂苷類物質(zhì)[4]。1976年，日本學(xué)者Kitagawa便從刺參(stichopus japonicus shlenka)中分離出具有顯著抗真菌活性的皂苷類物質(zhì)，holotoxin A和B[5]，現(xiàn)已經(jīng)成為腳氣和腳癬的治療藥物。此后，對棘皮動物皂苷的研究倍受學(xué)者們關(guān)注。

鮮海參體內(nèi)因具有自溶酶，因此在加工過程中，首先要用沸水煮制進(jìn)行滅酶處理，但在煮制過程中，有許多營養(yǎng)成分和功效成分會流失在加工廢液中，尤其是極性較大的皂苷類成分，如果能進(jìn)行再利用不僅可避免因直接排放所引起的環(huán)境污染而且還能避免大量海參皂苷的流失，對于開發(fā)純天然抗真菌海洋藥物將具有重要意義。

目前，對海參皂苷的提取主要采用乙醇或甲醇等有機(jī)溶劑的萃取法[3]。但這類方法有機(jī)溶劑的使用量大、成本高、易污染環(huán)境、不適于工業(yè)化生產(chǎn)。為此，本文研究、優(yōu)化和建立了利用AB-8大孔樹脂從海參加工廢棄液中提取海參皂苷的最優(yōu)技術(shù)工藝，為利用海參廢棄液規(guī)模化提取海參皂苷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:海參加工廢棄液，由好當(dāng)家集團(tuán)有限公司提供。

試劑:石油醚、正丁醇、無水乙醇均為分析醇。

1.2 大孔樹脂預(yù)處理

精確稱取AB-8型大孔吸附樹脂(天津南開化工廠)60g，用95%乙醇浸泡24h后裝柱(30mm×300mm，柱體積約為50mL)。用95%乙醇洗柱，流速為2倍柱體積(BV)/h，至洗脫液加水不出現(xiàn)白色混濁為止，經(jīng)去離子水洗柱至無醇味后再用200mL的5%HCl溶液洗柱(流速2～4BV/h)并浸泡4h進(jìn)行酸處理，經(jīng)去離子水洗至中性后，最后用200 mL的2%NaOH溶液洗柱(流速2～4BV/h)并浸泡4h進(jìn)行堿處理。

海參皂苷的提取。

取同一批次的海參加工廢棄液500mL，調(diào)節(jié)pH值(9、10、11)后，8000r/min離心40 min，收集上清液上樣于預(yù)處理AB-8型大孔吸附樹脂柱，控制上樣速率(2、3、4 BV/h)，經(jīng)去離子水和20%乙醇溶液分別洗柱后，用乙醇溶液(50%、70%、90%)進(jìn)行洗脫，設(shè)定洗脫體積(2、4、6BV)，收集洗脫組分，減壓濃縮至浸膏狀，浸膏用40mL去離子水復(fù)溶后，8000r/min離心40min，上清液經(jīng)石油醚萃取脫脂后，水層利用水飽和正丁醇萃取三次，合并正丁醇層，減壓濃縮至浸膏狀，冷凍干燥后備用。

1.3 正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝

選擇制備工藝中對皂苷收率具有顯著影響的4種因素:海參加工廢棄液pH值、上樣速率、乙醇洗脫劑的濃度、洗脫體積，每種因素選擇3個不同水平，采用4因素3水平的正交實驗表L9(34)制備海參皂苷(詳見表1)，每個水平設(shè)3次平行實驗，分析不同水平的4種因素對海參皂苷收率的影響。

1.4 海參皂苷的性質(zhì)鑒定

皂苷的性質(zhì)鑒定參照張繼杰(1997)的方法進(jìn)行[7]。泡沫試驗:取海參皂苷凍干品5mg，完全溶解于2mL去離子水中，振蕩1min后，觀察泡沫的產(chǎn)生情況。沉淀反應(yīng):取海參皂苷凍干品5mg，完全溶解于1mL去離子水中，加入少許氯化鋇，充分搖勻溶解后，觀察白色沉淀的有無。Molish反應(yīng):取海參皂苷凍干品5mg，完全溶解于2mL去離子水中，加入2～3滴10%α-萘酚醇溶液，充分搖勻后，沿離心管壁加入1mL濃硫酸，觀察兩液層交界面處紫色環(huán)的出現(xiàn)情況。Libermann Burchard反應(yīng):稱取海參皂苷凍干品5mg，加3mL醋酐充分溶解后，加入1滴濃硫酸，充分搖勻，觀察顏色的變化情況。

1.5 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理

正交實驗數(shù)據(jù)用正交設(shè)計軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參皂苷制備技術(shù)工藝的正交實驗

以海參皂苷制品的收率(重量)為指標(biāo)，按照表1中的L9(34)正交實驗順序，4種因素3個水平AB-8大孔樹脂提取海參皂苷收率的正交實驗結(jié)果見表2，其方差分析見表3。

由表2，3可知，利用AB-8大孔樹脂從海參加工廢棄液中提取海參皂苷，各因素對海參皂苷收率的影響為:C＞D＞B＞A。在實驗范圍內(nèi)，最佳優(yōu)選條件組合為C2D3B1A2，即海參加工廢棄液pH值為10、上樣速率為2BV/h、洗脫用乙醇濃度為70%，洗脫體積為6 BV。

2.2 海參皂苷制品的性質(zhì)鑒定

對海參皂苷制品的性質(zhì)鑒定結(jié)果見表4。制品的水溶液經(jīng)振蕩后產(chǎn)生了持久的泡沫，說明樣品中可能含有蛋白、皂苷類物質(zhì);皂苷制品在Libermann Burchard反應(yīng)中呈陽性，說明有三萜類皂苷的存在;皂苷制品在沉淀反應(yīng)、Molish反應(yīng)中也呈陽性，進(jìn)一步證明了其確具有皂苷的性質(zhì)。

3 討論

海參皂苷作為海參的次生代謝產(chǎn)物，除對酵母菌、霉菌等多種真菌有很強(qiáng)的抗真菌活性外，還具有顯著的抗腫瘤活性以及多種免疫調(diào)節(jié)作用[5，6]，因此海參皂苷是海洋抗真菌藥物等研制的重要候選者。目前，對海參皂苷的分離純化多采用醇提取、大孔樹脂柱層析、硅膠柱層析和HPLC等技術(shù)方法[7，8，9]，但這些方法操作繁瑣，不適于海參皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)。為了解決這一問題，我們在業(yè)已建立的海參皂苷提取方法的基礎(chǔ)上，通過正交實驗對利用AB-8大孔樹脂提取海參皂苷的技術(shù)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，旨在建立利用海參加工廢棄液規(guī)模化生產(chǎn)海參皂苷的最佳技術(shù)工藝，為將海參皂苷早日開發(fā)為抗真菌海洋藥物奠定基礎(chǔ)。

在利用AB-8大孔樹脂提取海參加工廢液海參皂苷的技術(shù)工藝中，廢棄液的pH值、上樣速率、洗脫劑乙醇的濃度和洗脫體積等因素對皂苷的收率均具有很大的影響，對皂苷的規(guī)模化生產(chǎn)至關(guān)重要。因此，本文選擇了這4種因素的3個水平進(jìn)行了正交實驗。實驗結(jié)果證明，洗脫劑乙醇的濃度對海參皂苷收率的影響作用最大，洗脫體積次之，上樣速率和廢棄液pH值的影響作用較小。在上述條件下所提取的海參皂苷在泡沫實驗、Molish反應(yīng)、沉淀實驗、Libermann-Burchard反應(yīng)中均呈現(xiàn)為陽性，說明提取物確為皂苷類物質(zhì)。從而確定了利用AB-8大孔樹脂提取海參皂苷的最佳技術(shù)條件:海參加工廢棄液→調(diào)pH至10→上樣于AB-8大孔樹脂(上樣速率:2×柱體積/h)→去離子水洗柱→50%乙醇洗柱→70%乙醇洗脫(6×柱體積)→收集洗脫組分→減壓濃縮→去離子水復(fù)溶→離心收集上清液→石油醚萃取脫脂→水飽和正丁醇萃取(3次)→合并正丁醇層→減壓濃縮→冷凍干燥。

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