海藻酸鈉作為固定化細胞包埋劑的研究

摘 要:通過正交實驗和單因素實驗，研究了包菌量，海藻酸鈉(SA)濃度，交聯時間和小球直徑四個因素對海藻酸鈉包埋菌株的脫氮性能的影響，并優選出最佳包埋條件。在最佳包埋條件下包埋的脫氮菌株的脫氮性能優于其游離狀態下的脫氮性能。

關鍵詞:海藻酸鈉 固定化 包埋 異養硝化 好氧反硝化

中圖分類號:X703.5文獻標識碼:A文章編號:1674-098X(2011)01(b)-0012-02

Abstract:Orthogoal experiments and one-factor experiments were designed to optimize optimum conditions. Quantity of entrapmenting bacteria，concentration of sodium alginate，crosslinking time，diameter of the immobilized beads were studied.Under optimum conditions，its nitrogen removal ability of immobilized bacteria was similar to the dissociation bacteria.

Key Words:sodium alginate;immobilization;entrapment;heterotrophic nitrification;aerobic denitrification

大量含氮廢水排入水體會給環境帶來一系列的危害:氨氮排入湖泊、海灣等容易引起水體富營養化，甚至會導致湖泊的干涸死亡。廢水脫氮已成為國內外的研究熱點。利用異養硝化好氧反硝化菌可以實現含氮廢水的高效脫氮[1-5]。菌株的保存與運輸顯的尤為重要。固定化工藝可以使菌株便于保存和運輸。本實驗對該實驗室已經篩選出的高效脫氮菌株進行固定化研究，對菌株廣泛應用于實際廢水處理工程奠定了一定基礎。

細胞固定化技術，是利用物理或化學手段將游離的微生物(細胞)或酶，定位于限定的空間區域，并使其保持活性且能反復利用的一項技術[6]。根據微生物細胞與載體的作用力及作用形式、微生物細胞被固定的狀態以及載體的性質將固定化細胞的制備方法分為以下三類:主要有吸附法、包埋法和交聯法三大類。包埋法是近年來發展迅速的一種新興細胞固定化技術，也是目前細胞固定化研究和應用最廣泛的方法[7，8]。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

一株具有異養硝化好氧反硝化脫氮性能的蠟狀芽孢桿菌，編號為WXZ-8;海藻酸鈉，氯化鈣，氯化鋇。

異養硝化培養基(/L)∶(NH4)2SO4∶0.47g，檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O)∶5.1g;碳源用量依據正交實驗設計COD/N比調節，KNO3∶0.1g，維氏鹽溶液50ml;加水溶解，補充蒸餾水至1L，并同時調節初始pH值。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化小球的制備過程

配制5%(質量比)的海藻酸鈉溶液，加熱使其充分溶解;同時配制含有4%CaCl2+1% BaCl2的交聯劑。將海藻酸鈉溶液和交聯劑放入高壓滅菌鍋中在121℃溫度下滅菌20分鐘，然后放入已滅菌的無菌操作臺中冷卻至室溫。

稱取一定質量的離心(8000r/min，5min，4℃)后的菌株放入已滅菌的燒杯中，加適量無菌水混合均勻后再與海藻酸鈉溶液混合均勻，用注射器(或移液器)吸取混合液，均勻滴至交聯劑中。在4℃冰箱中交聯一段時間后，用無菌水清洗小球，然后放入無菌水中或將其干燥后放入自封袋中在4℃冰箱內保存。

1.2.2 測定方法

(NH4+-N)采用納氏試劑分光光度法測定;ρ(NO2-N)采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定;ρ(NO3-N)采用紫外分光光度法測定;pH采用德國WTW便攜式測定儀測定。

2 實驗結果與討論

2.1 正交實驗

通過設計四因素三水平正交實驗，優化海藻酸鈉包埋WXZ-8菌株的包埋條件。各因素和各水平的選擇是參考有關研究擬定的。試驗因素有:加入包埋劑中的細菌量(簡稱包菌量)、包埋劑濃度、交聯時間及小球直徑，以固定化菌株的脫氮性能(即:氨氮和總氮去除率)為指標。各因素因子的水平取值見表1所示。

按1.1配制異養硝化培養基，調節pH至7.0，并分裝在250ml的錐形瓶中，在121℃條件下高壓滅菌20min，然后放至已滅菌的操作臺中冷卻至室溫。稱取濕重為10g(相當于干重約1g)的小球，放至培養基中。然后放在恒溫振蕩搖床內培養。

培養條件為:溫度為30℃，轉速為90r/min(相當于DO濃度3.76～4.84mg/L)， COD/N為25，氮源為硝酸鉀和硫酸銨，初始NO3--N和NH4+-N濃度分別約為10mg/L和100mg/L，碳源為檸檬酸三鈉。培養4天，每隔24h取樣一次，取樣后先離心分離，然后取上清液對NH4+-N、NO3--N和NO2--N濃度進行測定，TN濃度為NH4+-N、NO3--N和NO2--N濃度之和，計算NH4+-N和TN去除率，取其最大值。實驗結果見表2。

表2中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示水平，j表示因素，如ⅡA表示海藻酸鈉濃度為5%的所有包埋條件，此條件在表中是實驗2、實驗5、實驗8，ⅡA的值應為三個對應條件下的結果加權平均值。每個因素不同水平下的平均值相差最大的二個數的差值，即為極差Rj。極差的大小反映各因素對指標影響的大小。即極差越大，因素對指標影響越大。最優水平的確定是根據Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj的大小選定的，平均值越大表明該水平越有利于指標結果，各最優水平的綜合即為理論最優條件。

以NH4+-N去除率為指標，分析表中數據:(1)以包菌量(因素A)為例，由表2中的加權平均值比較得出，ⅡA＜ⅢA＜ⅠA，所以因素A的最佳水平應取1水平，即包菌量為2%。其他同理。(2)因素影響分析:極差的大小反映各因素對指標影響的大小。在實驗的三個因素中，因素A的極差最大，為10.2，其次是D，C，B最小，從而可排出因素影響的順序為:A＞＞D＞C＞B，即包菌量＞小球直徑＞交聯時間＞SA濃度。(3)優選方案的得出:由以上分析可見各因素理論最佳水平為:因素A取1水平，因素B取3水平，因素C取3水平，因素D取2水平。因此實驗的最優方案為:A1B3C3D2，即:包菌量為2%，SA濃度為7%，交聯時間為12h，小球直徑為3mm。

以TN去除率為指標分析，分析方法同上，得出以下結論:(1)因素影響分析:極差的大小反映各因素對指標影響的大小。在實驗的四個因素中，因素A的極差最大，為8.7，其次是C，D，B最小，從而可排出因素影響的順序為:A＞＞C＞D＞B，即包菌量＞交聯時間＞小球直徑＞SA濃度。(2)優選方案的得出:由以上分析可見各因素理論最佳水平為:因素A取3水平，因素B取1水平，因素C取3水平，因素D取1水平。因此實驗的最優方案為:A3B1C3D1，即:包菌量為6%，SA濃度為4%，交聯時間為12h，小球直徑為2mm。

以NH4+-N去除率為指標分析所得的優選方案與以TN去除率為指標分析所得的優選方案不完全一致。包菌量(因素A)對菌株活性影響最大，海藻酸鈉濃度對其影響最小。綜合考慮，最終得到優選方案:A1B2C3D1，即包菌量為2%、SA濃度為5%、交聯時間為12h，小球直徑為2mm。正交實驗中，第七組實驗的包埋小球的活性最強，氨氮和總氮去除率分別為99.7%和99.8%。

2.2 單因素實驗

由表2可以看出，當包菌量由2mg/L增長到6mg/L時，包埋小球的脫氮性能先減弱后增強。因此通過補充單因素實驗，選擇最佳包菌量。

單因素實驗是在海藻酸鈉濃度為5%，交聯時間為12h，小球粒徑為2mm條件下通過改變包菌量，進行包埋實驗。本實驗選擇的包菌量為1%、2%、4%、6%、8%。實驗結果如圖1所示。

由圖1可以直觀的看到，包菌量在1%～2%和6%～8%區間范圍內，其TN和NH4+-N去除率差別并不大。在單因素實驗中包埋菌株活性最強時，氨氮和總氮去除率分別為99.7%和99.8%，比正交實驗第七組實驗條件下制備的包埋小球的活性弱。因此選定WXZ-8號菌株最佳包埋條件是包菌量(A)為2%，海藻酸鈉濃度(B)為5%，交聯時間(C)為12h，小球粒徑(D)為2mm。

經過實驗測定，在WXZ-8包埋小球的最佳培養條件下，其NH4+-N去除率和TN去除率分別為，相比游離菌的NH4+-N去除率與TN去除率分別為96.3%和93.8%，WXZ-8號菌包埋小球的活性好于其游離菌。

3 結語

(1)WXZ-8號菌株最佳包埋條件是包菌量(A)為2%，海藻酸鈉濃度(B)為5%，交聯時間(C)為12h，小球粒徑(D)為2mm。

(2)WXZ-8號菌包埋小球的活性優于其游離菌的活性。

參考文獻

[1]林燕，孔海南，何義亮.異養硝化細菌的分離及其硝化特性試驗研究[J].環境科學.2006，27(2):324 -328.

[2]劉晶晶，汪蘋，王歡.一株異養硝化-好氧反硝化菌的脫氮性能研究[J].環境科學研究，2008，21(3):122-125．

[3]Van Niel EWJ，Braber KJ，Roberson LA. Kuenen JG. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification in Alcaligenes faecalis strain TUD[J]. Antonie van Leeuwenhoek，1992，62:231-237.

[4]Roberson L A，Revsbech NPDT，Kuenen JG. Confirmation of aerobic denitrification in batch culture using gas chromatography and mass spectrometry[J]. FEMS Microbiology Ecology，1995，18:113-120.

[5]Hung-Soo Joo，Mitsuyo Hirai，and Makoto Shoda.Characteristics of Ammonium Removal by Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification by Alcaligenes faecalis No.4[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2005，100(2):184-191.

[6]王新，李培軍，鞏宗強，等.固定化細胞技術的研究與進展[J].農業環境保護，2001，20(2):120-122.

[7]黃霞，俞毓馨，王蕾.固定化細胞技術在廢水處理中的應用[J].環境科學，1993，14(1):41-48.

[8]肖美燕，徐爾尼，陳志文.包埋法固定化細胞技術的研究進展[J].食品科學，2003，24(4):158-161.

[9]王磊.固定化硝化菌去除氨氮的研究[J].環境科學，1997，18(2):18.

[10]李峰，呂錫武等.聚乙烯醇作為固定化細胞包埋劑的研究[J].中國給水排水，2000，16(12):14-17.

[11]李蕾，李杰，等.生物細胞固定化技術中的包埋材料[J].凈水技術，2005，24(1):40-42.