干擾素對腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)影響的實(shí)驗研究

[摘要]目的：探討干擾素（IFN）對體外培養(yǎng)的腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕來源的成纖維細(xì)胞生物學(xué)作用的影響。方法：制作兔腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕動物模型，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等方法觀察、分析rhIFNα-2b和rhIFN-γ對腭裂術(shù)后瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，數(shù)據(jù)采用方差分析及q檢驗處理。結(jié)果：與對照組比較，實(shí)驗組加入干擾素后，腭裂術(shù)后瘢痕成纖維細(xì)胞的生長趨勢及增殖活性及被明顯抑制，S-G2-M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯降低。結(jié)論：干擾素對腭裂術(shù)后瘢痕成纖維細(xì)胞的生長趨勢及增殖活性具有明顯抑制作用，說明在防治腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕的形成中有一定的應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞]腭裂；瘢痕；成纖維細(xì)胞；rhIFNα-2b；rhIFN-γ

[中圖分類號]R619+.6R782.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）06-0926-03

Empirical study of interferon affecting on the fibroblasts of the exposed bone surface from cleft palate scar

TAO Ming1，2，HU Chao3，DING Ding1，ZHAO Li-li1，ZHAN Jia1，SUN Hui1，SUN Hui1，WANG Yuan-yin1，ZHOU Jian1

(1.Stomatological Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230032，Anhui，China;2.Department of Stomatology，Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 24100，Anhui，China;3.Department of Stomatology，The Third Military Medical University，Chongqing 400037)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of interferon to the biological activities of fibroblasts origined from the exposed bone surface from cleft palate scar in vitro cultural. MethodsMaking rabbit cleft palate scar models， in vitro culture，observed by MTT assay and flow cytometry， analysis the effects of interferon to the biological activities of fibroblasts origined from the exposed bone surface of cleft palate scar. Data using analysis of variance and q test treatment. ResultsCompared with the control group，after added interferon， cleft palate fibroblast's growth trends and value-added activity of experimental group was inhibited significantly. Percentage of cells decreased during the S-G2-M stage.ConclusionsInterferon on the growth trends and value-added activity of the cleft palate fibroblast has significant inhibitory effect， indicating that cleft palate in the prevention of scar formation of the exposed bone surface has some value.

Key words:cleft palate；scar；fibroblast；rhIFNα-2b;rhIFN-r

先天性腭裂發(fā)病率約占人口出生率的1/700左右，嚴(yán)重影響患者的口腔頜面部器官的形態(tài)與功能及心理健康。雖然目前的外科技術(shù)已能實(shí)現(xiàn)對腭部裂隙的良好修復(fù)，有助于語音及吞咽功能的恢復(fù)，但大量的臨床與基礎(chǔ)研究證實(shí)，術(shù)后患者上頜骨的生長發(fā)育繼發(fā)畸形會變得更為嚴(yán)重，對患者的頜面形態(tài)與功能構(gòu)成嚴(yán)重危害。腭裂術(shù)后上頜骨繼發(fā)生長畸形的病理解剖學(xué)基礎(chǔ)已經(jīng)探明是腭裂術(shù)后遺留在上頜骨硬腭的裸露骨面瘢痕攣縮所致[1-2]。因此，如何防治腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕形成是目前口腔頜面外科領(lǐng)域亟待解決的難題之一。在瘢痕的形成與增生過程中，成纖維細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，其功能狀態(tài)是影響瘢痕發(fā)生、發(fā)展、以及轉(zhuǎn)歸的主要因素。干擾素（IFN）具有抗病毒、抗腫瘤、影響細(xì)胞增殖分化等多種生物學(xué)效應(yīng)。臨床上已經(jīng)有將干擾素用于防治瘢痕形成的報道，但用干擾素觀察腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未見報道，本實(shí)驗通過體外觀察和研究干擾素對腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用，可為尋求應(yīng)用干擾素治療腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕提供實(shí)驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗試劑：DMEM培養(yǎng)基（低糖 美國Sigma公司），新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（美國Sigma公司），PBS(pH7.2～7.4)液，Hank's(pH7.2～7.4)液（自配），rhIFNα-2b和rhIFN-γ（安徽安科生物工程股份有限公司），MTT溶液（5mg/ml）(美國Amresco公司)，二甲亞砜（DMSO，分析純）。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1兔腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕動物模型的制備：成年大耳白兔6只（合肥工業(yè)大學(xué)控釋藥物研究中心動物室提供），體重2千克，3%戊巴比妥鈉溶液按30mg/kg進(jìn)行耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定四肢，張口，沿腭中縫做縱行切口，逐層切開腭部軟組織，骨膜分離器左右分離軟組織，顯露出上腭裸露骨面，徹底止血后沿切口縫合。麻醉效應(yīng)過后，兔肢體可自由活動，術(shù)后連續(xù)5天每日肌注80萬單位青霉素，術(shù)后4周在全麻下沿原切口切開，取腭部裸露骨面上的瘢痕組織以進(jìn)行下一步實(shí)驗。

1.2.2腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代：采用組織塊法進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)(見照片2)，用含15%新生小牛血清DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2～4天更換培養(yǎng)液，待原代培養(yǎng)長出的成纖維細(xì)胞接近或達(dá)到融合時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.3細(xì)胞生長增殖情況（MTT測定法）：取第3～5代生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后用15%新生小牛血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)位1×106/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，共2板，每孔加入200μl，并留下不含細(xì)胞和培養(yǎng)液的調(diào)零孔，將96孔板移入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h。取出96孔板，棄上清液，每孔加入200μl無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出96孔板，換新培養(yǎng)液，實(shí)驗1組分別加入濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFNα-2bDMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗2組分別加入濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFN-γDMEM培養(yǎng)液每孔液體總量為200μl；對照組加相同容積的DMEM培養(yǎng)液；每一濃度藥物設(shè)6個平行孔。將96孔板置入37℃、5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)24、48h。

MTT測定法：取出96孔板，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后取出，小心吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收（OD）值。

1.2.4細(xì)胞周期分析(流式細(xì)胞術(shù))：取第6～8代生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，接種于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)24h。棄原培養(yǎng)液，加入無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行細(xì)胞同步化處理。實(shí)驗1組分別加入終濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFNα-2bDMEM培養(yǎng)液；實(shí)驗2組分別加入終濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFN-γDMEM培養(yǎng)液；對照組加入相同容積的DMEM培養(yǎng)液，每組3瓶。將培養(yǎng)液置入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48h；0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，1 000r/min離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，70%冰乙醇固定18h，4℃保存；PI綜合染液室溫下避光染色30min，300目尼龍網(wǎng)膜過濾，流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理：實(shí)驗結(jié)果用x±s表示，采用方差分析及q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 干擾素抑制腭裂術(shù)后瘢痕成纖維細(xì)胞生長增殖：MTT比色實(shí)驗測定結(jié)果顯示，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ培養(yǎng)24h后實(shí)驗組于對照組OD值之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），培養(yǎng)48h后，與對照組比較，2 000U/ml濃度組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），4 000、6 000、8 000、10 000U/ml濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），提示rhIFNα-2b和rhIFN-γ對腭裂術(shù)后裸露骨面成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用（見表1、表2）。

2.2干擾素對腭裂術(shù)后瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果顯示：對照組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)48h處于S-G2-M期的百分比為（44.54±3.21）%，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ作用48h，與對照組比較，2 000U/ml濃度組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而4 000、6 000、8 000、10 000U/ml濃度組處于S-G2-M期的百分比均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（見表3）。

3討論

國內(nèi)外研究已表明，腭裂術(shù)后硬腭部裸露骨面的形成及瘢痕修復(fù)將抑制患者上頜骨的生長，引起患者顏面部凹陷，反牙合等畸形和功能障礙。有研究表明裸露骨面的瘢痕組織，由于缺少大血管和彈力纖維，膠原纖維呈橫向走行并通過沙比纖維附著于硬腭骨上，而且粘骨膜與牙周韌帶相延續(xù)，因此在收縮時，對牙弓產(chǎn)生向內(nèi)的牽張力，從而導(dǎo)致了面中份骨的發(fā)育不足[3]。創(chuàng)傷愈合是人體組織修復(fù)的一種過程，而瘢痕形成則是過度愈合或愈合紊亂。瘢痕中的成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合、瘢痕形成、增生和攣縮的功能性細(xì)胞，其增殖、活化、分化的異常直接導(dǎo)致病理性瘢痕的形成。干擾素是一類具有抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性的細(xì)胞因子。它是目前比較明確的瘢痕增生負(fù)性調(diào)節(jié)因子[4-5]。近年來，許多體外研究表明干擾素具有抑制成膠原的合成，促進(jìn)膠原降解以及激活膠原酶的活性，起到對病理性瘢痕中成纖維細(xì)胞的抑制作用[5-6]。臨床上也有局部注射干擾素來治療病理性瘢痕的報道[7-8]。然而，干擾素是否對腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕來源的成纖維細(xì)胞有抑制作用，之前未見報道。本實(shí)驗將干擾素作用于體外培養(yǎng)的兔腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕成纖維細(xì)胞中，結(jié)果表明對細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用。

我們?yōu)榱四軌驅(qū)⒏蓴_素應(yīng)用到預(yù)防腭裂術(shù)后的繼發(fā)畸形中，于是在此首先觀察了rhIFNα-2b和rhIFN-γ對體外培養(yǎng)的腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕來源的成纖維細(xì)胞的作用，以便為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗顯示，IFN在較高濃度時對瘢痕成纖維細(xì)胞的生長增殖具有明顯的抑制作用。本實(shí)驗中采用MTT法檢測IFN對成纖維細(xì)胞生長增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入IFN48h后，4 000～10 000U/ml濃度組OD值明顯低于對照組（P＜0.05，P＜0.01），說明實(shí)驗組的細(xì)胞比對照組細(xì)胞生長要慢，活細(xì)胞數(shù)相對較少，提示IFN對細(xì)胞增殖活性產(chǎn)生了抑制作用。但實(shí)驗組細(xì)胞48h的OD值與24h相比仍然有所增加，說明rhIFNα-2b不能絕對抑制細(xì)胞增殖，而是抑制了細(xì)胞的增長趨勢。由于MTT比色法測定反映的是細(xì)胞總數(shù)，于是我們又應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定了細(xì)胞總數(shù)中各細(xì)胞周期的百分比，反映細(xì)胞中處于分裂期的總體比例，能準(zhǔn)確地揭示群體細(xì)胞中具有分裂能力的細(xì)胞量。結(jié)果顯示加入IFN后在短時間內(nèi)（24 h）與對照組無明顯差別，而延長觀察時間（48h） 則整體瘢痕成纖維細(xì)胞中處于S-G2-M期的比例降低（2 000 U/ml濃度組除外）。說明加入的IFN的抑制活性與細(xì)胞數(shù)量改變之間有一定的時間濃度依賴關(guān)系。我們預(yù)測：高濃度的IFN在促使瘢痕組織軟化、預(yù)防和治療瘢痕攣縮方面可以發(fā)揮作用。

本研究分析測定了IFN對瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。體外實(shí)驗肯定了IFN對腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕的成纖維細(xì)胞的生長趨勢及增殖具有顯著的抑制作用。雖然其具體的作用機(jī)制目前尚未完全清楚，但為進(jìn)一步進(jìn)行活體實(shí)驗提供了依據(jù)，也為臨床上預(yù)防和治療腭裂術(shù)后裸露骨面瘢痕形成及術(shù)后上頜骨繼發(fā)畸形提供了重要的參考信息。

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[收稿日期]2011-03-18 [修回日期]2011-05-14

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、公式、注解等請以PDF格式閱讀”