硒化殼聚糖促表皮細胞增殖作用的實驗研究

[摘要]目的：研究硒化殼聚糖對體外培養表皮細胞增殖的影響。方法：用不同劑量（25、50、100、200、400mg/L）硒化殼聚糖作用于表皮細胞，電鏡觀察藥物對細胞超微結構的影響； 3H－TdR摻入法、LDH漏出率用于檢測藥物對細胞增殖及損傷的影響，并以等體積的細胞培養液處理為對照組。結果：各藥物濃度作用細胞后，細胞核均有不同程度的增大，核漿比增大，核仁變大，變多，擴張的內質網增多，細胞表面突起增加，線粒體更為豐富，更易見到聚集成團的糖原等現象；硒化殼聚糖可促進表皮細胞對3H－TdR的吸收(P<0.05，P<0.01)，降低LDH漏出率(P<0.05，P<0.01)。結論：硒化殼聚糖能促進體外培養表皮細胞增殖。

[關鍵詞]硒化殼聚糖;表皮細胞；增殖

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）06-0941-03

The promoting proliferation effect of selenium chitosan on the epidermal cell cultured in vitro

DENG Shou-heng1，WU Fang-yi2，KE Xian-zhu3， REN Ni-li1， CHEN Ping1，CHEN Wen4

(1.Center of Oncology，People's Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000，Hubei，China; 2.Department of Dermatology， People's Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000， Hubei， China; 3.Department of Orthopedics，People's Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000，Hubei，China;4. Department of Orthopedics， Taihe Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000，Hubei，China)

Abstract: ObjectiveTo study the effects of selenium chitosan on the proliferation of culturedEpidermal cell in vitro.MethodsThe culturedEpidermal cell were treated with selenium chitosan at concentrations of 25、50、100、200、400 mg/Land the equal volume of media as control group.the ultrastructures of Epidermal cell were studied under electron microscope; the effect on cell proliferation was measured by 3H－TdR infiltration and the damage to cell was measured by the leakage rate of LDH.ResultsThe electron microscope showed that in the test group the nucleus endoplasmic reticulum mitochondrion glycogen and the ratio of nucleus to cytoplasm increased or became bigger in a concentration dependence manner. Compared with control group， selenium chitosan could enhance the absorption to3H-TdR (P<0.05， P<0.01)and decrease the leakage rate of LDH (P<0.05， P<0.01).ConclusionSelenium chitosan could promote the proliferation of Epidermal cell cultured in vitro.

Key words: selenium chitosan; Epidermal cell; proliferation

殼聚糖[1]是來自海洋生物的多糖，因其生物相容性良好，幾乎無毒性和不良反應，在現代藥物制備中常作為良好的藥物材料進行開發。硒是一種具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種功效的微量元素，自然界中的硒多為無機硒，存在著不易被細胞吸收，劑量不易控制等缺點。硒化殼聚糖[2]是將殼聚糖與亞硒酸通過拼合原理制備成的有機硒，可有效克服無機硒的上述缺點。創傷是最常見的損傷，有報道稱創傷后的局部皮膚組織和血尿等體液中存在著硒的缺乏[3-4]，而補硒則能明顯促進參與深部創面修復的主要細胞皮膚成纖維細胞的增殖[5]，補硒對參與淺部損傷修復的表皮細胞影響如何，本文對此進行了報道。

1材料和方法

1.1 藥品試劑與儀器：硒化殼聚糖由福建醫科大學藥化系合成； DMEM培養基、胰蛋白酶及小牛、胎牛血清購自Gibco公司；乳酸脫氫酶（LDH）購自Sigma公司；3H－脫氧胸腺嘧啶核苷酸（3H－TdR）購自北京中國原子能研究所。Hu12A型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；BeckmanLX20全自動生化測定儀（美國Beckman Coulter公司）；LS3801型液閃計數儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將術中取下的包皮（患者知情同意）在無菌條件下漂洗，去除皮下組織，剪成1mm×1 mm×1 mm組織塊，培養于含15%胎牛血清的DMEM培養液中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。每3天換1次液。待長成致密單層后，用濃度為2.5g/L的胰酶消化，按體積比為6傳代，將第6代細胞用作實驗，根據硒化殼聚糖濃度不同分為空白對照組、25、50、100、200、400 mg/L組共6組。

1.2.2 電子顯微鏡觀察細胞超微結構變化[6]： 取第6代細胞，5×103個/ml接種于24孔板，每孔0.5ml，培養24h后加入藥物繼續培養48h，0.5%胰酶消化后移入錐形管中，離心收集細胞，電鏡下觀察。

1.2.3 3H－TdR摻入法測定DNA合成：取第6代細胞， 5×103個/ml接種于96孔板，每孔接種100μl，培養48h，按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續培養24h后加入3H－TdR37MBq/L，繼續培養24h后用0.25%胰蛋白酶消化并轉移至玻璃纖維濾紙上，依次用生理鹽水、10%三氯醋酸、無水乙醇沖洗固定干燥后加閃爍液，液閃計數儀測定每分鐘閃爍次數值（count per minute，CPM）。

1.2.4 LDH漏出率的測定：取第6代細胞， 5×103個/ml接種于96孔板，每孔接種100μl，培養48h， 按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續培養24h，用全自動生化分析儀檢測上清液中LDH的含量，將培養板中的細胞用0.25%胰酶消化，收集細胞，超聲波粉碎后加入PBS液，用全自動生化分析儀檢測LDH的含量，LDH漏出率的計算公式[7]：

漏出率＝（LDH上清液－LDH胞內）/ LDH胞內。

1.2.5統計學處理 數據均以x±s表示，應用SPSS 13.0統計軟件進行方差分析。

2結果

2.1電鏡下觀察結果：透射電鏡下空白組的細胞核仁可見，多為單個，少量細胞也可見多個核仁， 細胞表面可見微絨毛。各濃度硒化殼聚糖組細胞表面微絨毛豐富，核大，扭曲明顯，有深凹陷，核內異染色質稍多，呈小斑塊狀散在分布于核基質中，核仁大，常多個（2～3個）有時可達4個，有少數細胞體積明顯增大，部分細胞內見多個核切面。細胞漿內糖原豐富，有線粒體和粗面內質網，有些高爾基體也較發達，細胞多處于分裂期。見圖1。

2.2硒化殼聚糖對表皮細胞LDH漏出率和DNA合成的影響: 硒化殼聚糖可降低表皮細胞LDH漏出率，藥物濃度越大漏出率降低越明顯，呈劑量依賴趨勢，當藥物濃度為100mg/L及以上時，對LDH漏出率的影響與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05， P<0.01)。各濃度硒化殼聚糖均可促進表皮細胞對3H－TdR的攝入， 25mg/L組cpm值即大于空白對照組（P<0.05），200、400mg/L組cpm值遠大于空白對照組（P<0.01）。見表1。

3討論

3.1 創面愈合是一個復雜有序的過程，深度損傷的修復主要通過肉芽組織的生成來實現，淺表損傷修復則主要通過上皮細胞的增殖、遷移來完成。創面愈合包括炎癥反應、細胞增殖、創面成熟和重建三個階段，炎癥反應啟動并全程參與了創面修復過程，硒化殼聚糖主要是由具有抗炎等活性的硒和殼聚糖合成，理應會對創面愈合過程產生影響，而前期的研究也證實了其能通過影響一氧化氮和相關細胞因子的分泌促進肉芽組織中主要細胞皮膚成纖維細胞增殖和膠原的合成[8-9]。

3.2 本文中，筆者在電鏡下觀察了經硒化殼聚糖處理后的表皮細胞，結果顯示，細胞內各超微結構均呈現出增殖旺盛的特征，濃度越高，增殖旺盛特征越明顯。細胞生物學研究表明，分裂旺盛的細胞呈現出細胞核變大、核仁增多、增大、細胞表面突起增多等特征。糖原是細胞合成、分泌、代謝等生物學活動的能量來源，糖原增多可間接提示細胞代謝旺盛；粗面內質網是由內質網和核糖體共同形成的一個復合機能單位，是細胞進行生物合成的重要基地，其發達程度可作為判斷細胞分化和功能狀態的指標，細胞合成代謝活躍或分泌活動旺盛時粗面內質網數目增多，功能相對減弱時則數目減少。為進一步驗證硒化殼聚糖對表皮細胞的促增殖作用，筆者又采用了3H－TdR摻入法進行檢測，脫氧胸腺嘧啶核苷酸（TdR）是合成DNA的原料之一，細胞增殖旺盛則DNA合成加快，細胞對TdR的需求量增加。結果發現經硒化殼聚糖作用后表皮細胞對3H－TdR摻入量明顯增強，促進了表皮細胞DNA的合成和增殖，與電鏡下觀察結果一致。

3.3 LDH是存在于細胞漿內參與糖酵解反應的酶，進行離體細胞培養時，如果培養的細胞受損，LDH會由細胞漏出至培養液中，通過測定培養液中LDH水平可衡量細胞受損的程度，間接反映藥物的安全性[10]。本實驗中硒化殼聚糖非但沒有增加，相反卻能降低LDH漏出率，說明硒化殼聚糖對表皮細胞尚有一定的保護作用，這與在細胞超微結構中并未見到有顯著的空泡增多、細胞溶解等細胞損害現象相一致。

硒化殼聚糖可促過參與深部損傷修復的主要細胞皮膚成纖維細胞增殖，也能明顯促進參與淺表損傷修復的表皮細胞增殖，提示硒化殼聚糖具有良好的促創面愈合的藥理作用，其作用機制及作用劑型值得進一步深入研究和開發。

[參考文獻]

[1]Zarzycki R，Modrzjewska Z.Use of chitosan in medicine and biomedical engineering[J].Polim Med，2003，33(1):47-58.

[2]孫蘭萍，張勝義，許暉. 硒化殼聚糖的制備及理化性質的研究[J]. 食品工業科技，2006，27(2):145-151.

[3]何麗，張雪，黃君富，等. 67例重度燒傷患者血清銅、鋅、錳、硒含量變化與SOD、GSH-PX活性關系的研究[J].第三軍醫大學學報，2006，28(21):2192-2194.

[4]韓兆峰，王甲漢，李志清，等.重度燒傷患者中后期肉芽創面多種微量元素的動態變化[J].南方醫科大學學報，2008，28(3):505-506.

[5]鄧守恒，吳方毅，柯賢柱，等.硒化殼聚糖促創面愈合作用的初步研究[J].中國美容醫學，2011，20(1):77-79.

[6]白希清.病理學[M].北京:科技出版社，1993:231-234.

[7]洪慶濤，宋岳濤，唐一鵬，等. 細胞培養液乳酸脫氫酶漏出率的比色測定及其應用[J].細胞生物學雜志，2004，226(1):74-79.

[8]鄧守恒，孫各琴，朱名安，等.硒化殼聚糖對體外培養成纖維細胞增殖及膠原合成的影響[J].中國臨床康復，2006，10(21):58-60.

[9]鄧守恒，楊敬寧，曹鳳軍，等. 硒化殼聚糖對體外培養人皮膚成纖維細胞分泌細胞因子及一氧化氮的影響[J].醫藥導報，2010，29(5):576-578.

[10]Lobner D.Comparison of the LDH and MTT assays for quantifying cell death: validity for neuronal apoptosis[J].J Neurosci Meth，2008，96(3):147-152.

[收稿日期]2011-03-29 [修回日期]2011-05-16

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、公式、注解等請以PDF格式閱讀”