脂肪組織工程研究進展

成功構建組織工程化脂肪的關鍵在于：①種子細胞的選定和獲取；②具有良好生物降解性和組織相容性的三維支架材料；③種子細胞增殖和分化的微環境。本文就這三方面的研究進展綜述如下：

1種子細胞的選定和獲取

選擇一種適宜的種子細胞是成功構建組織工程脂肪的前提。干細胞是一類未分化、保持多種分化潛能且長期生存的細胞群。干細胞按其分化階段的不同，可以分為胚胎干細胞和成體干細胞兩類。胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）具有多向分化潛能、長期未分化增殖能力和種系傳遞功能，但其來源不足、體外培養困難、定向誘導存在許多技術問題，用于臨床存在免疫排斥、致瘤性和倫理學問題，故限制了臨床應用[1]。成體干細胞來源豐富，取材方便，易實現自體取材，可克服宿主免疫排斥反應，故成體干細胞的研究很廣泛[2]。成體干細胞的研究主要集中在間充質干細胞，它可來源于各種組織，包括：骨髓、脂肪、肝、脾、胰腺、睪丸、月經血、真皮、牙髓，甚至肺等[3]。其中主要代表是骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、臍帶間充質干細胞。它們可通過冷凍、干燥、冷凍干燥等三種方法存儲[4]。

1.1 骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）:BMSCs是來源于骨髓間充質的成骨細胞的前體細胞，具有較強的自我增殖能力和多分化潛能，可分化骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、肌腱細胞和神經細胞等[5-6]。它的表面標記分子已明確，并已用于細胞篩選及計數。分離、純化骨髓間充質干細胞的方法有：全骨髓法、密度梯度離心法、免疫學分離法、貼壁篩選法、密度梯度離心與貼壁篩選相結合。現已證明密度梯度離心與貼壁篩選相結合，通過首次換液后頻繁更換新鮮培養液和傳代時縮短胰蛋白酶消化時間的方法，可得到純度和分化能力均比對照組高的BMSCs細胞群。骨髓間充質干細胞是自骨髓移植供者骨髓獲得，這種方法難免會給供者帶來痛苦，同時還可能導致供區并發癥。骨髓中的間充質干細胞含量極低，而且增殖與分化能力還受年齡的影響，年齡越大，其增殖分化能力也逐漸下降。這些因素限制了骨髓間充質干細胞的臨床應用。

1.2 脂肪間充質干細胞(adipos-derived mesenchymal stem cells，ADSCs):前脂肪細胞是脂肪細胞的前體細胞，可向成熟脂肪細胞分化。前脂肪細胞因子1(Pref-1)是一種前脂肪細胞特殊標志的跨膜蛋白，該蛋白隨著前脂肪細胞的分化而消失，因此前脂肪細胞因子1是前脂肪細胞的重要標記物[7]。前脂肪細胞的特點在于：能自發地分化成脂肪細胞，不會分化成軟骨細胞和成骨細胞等。但是前脂肪細胞在體外傳代培養幾代后，就失去了分化能力，不能為脂肪工程生成足量脂肪細胞。脂肪間充質干細胞是一種存在于脂肪組織的間充質干細胞，具有自我更新和多向分化的潛能，可分化成成脂細胞、成骨細胞、軟骨細胞、生肌細胞、內皮細胞[8]、肝細胞和神經細胞譜系。脂肪干細胞可以在任何白色脂肪組織中找到，包括皮下脂肪和網膜脂肪。通過脂肪抽吸術或脂肪切除術可獲得大量的脂肪干細胞群。在脂肪組織中，每克組織含5000個間充質干細胞；常規脂肪抽取液300ml可獲得在1×107和6×108之間不等的干細胞，并且90%以上的細胞具有活力，因此脂肪組織具有高密度的干細胞[9]。干細胞可通過膠原酶消化、反復過濾、離心而獲得SVF，然后傳代純化。取材需考慮性別、年齡、取材位置，這些因素會影響細胞的內分泌功能，從而影響到干細胞的增殖和分化[10]。與BMSCs相比，ADSCs在成脂分化培養下生長更快，活力更強[11]；而且培養時出現衰老的時間更晚。目前ADSCs的特異性表面標記物尚不明確，只了解到脂肪間充質干細胞表達CD13、CD29、CD44、CD49e、CD54、CD55、CD63、CD73、CD90、CD105、CD144、CD146、CD166，它不表達CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、STRO-1、CD3、CD117、CD62L、CD95L [12-13]。

1.3 臍帶間充質干細胞(Human umbilical cord mesenchym al stem cells，hUCMSCs):hUCMSCs是存在于華氏膠中的一種具有自我更新、增殖和多向分化潛能的成纖維細胞樣細胞。它與ADSCs、BMSCs和ESCs相比，具有以下優勢：來源豐富，成本低，不涉及倫理問題，不會給捐獻者帶來傷害，表達胚胎干細胞某些特異標志等。hUCMSCs分離方法主要有：酶消化法、組織塊貼壁法。在酶消化法中，由于臍帶是富含葡萄糖胺和膠原的組織，故多用透明質酸酶和膠原酶消化以獲得hUCMSCs[14]。hUCMSCs在體外被證實可向脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、骨骼肌細胞、神經細胞、神經膠質細胞、多巴胺能神經細胞、內皮細胞、肝細胞、胰島樣細胞、平滑肌細胞、生殖細胞等方向分化。hUCMSC高表達CD73、CD90、CD105、CD54、CD13、CD29、CD44，不表達CD34、CD45、CD14、CD33、CD13。

2支架材料

3T3-L1前脂肪細胞只有培養在三維環境下才能維持正常的細胞形態和功能，因此，尋找一個合適的生物支架材料是組織工程的關鍵。理想的支架材料需具備良好的生物相容性、良好的生物降解性、三維立體多孔結構及良好的細胞界面。目前已經有大量人工合成或天然來源材料被應用到脂肪組織工程中。合成支架的優點在于統一控制的條件下生產，可根據具體需要修改其化學和物理特性；天然材料的優點在于異物反應少。天然材料主要有：蠶絲、透明質酸、甲殼素、膠原和纖維蛋白等；人工合成的主要有：聚四氟乙烯、聚乙烯醉、聚乳酸（PLA）、聚乙酸醇（PGA）和聚乳酸-聚乙酸醇酸（PLGA）等。常用的主要有膠原支架、HYAFF11海綿支架(透明質酸衍生酯)、聚乳酸一聚乙醇酸共聚物支架等。

2.1 人工合成材料

2.1.1 PLGA:PGA和PLA具有可降解性、生物相容性、表面活動度，被廣泛運用于支架材料。PLGA（PGA和PLA的復合物）具有促進種子細胞的粘附、增殖、分化的特性，近年來研究比較廣泛。PLGA是通過孔隙間全連通的三維細胞支架，其自催化降解行為被明顯抑制，支架的外觀尺寸和孔隙率穩定，有利于獲得外觀尺寸穩定的工程化組織。但是，PLGA是通過水解酯鍵降解，降解產物乳酸和乙醇酸會降低周圍微環境的pH值，從而影響組織和細胞的粘附與生長[15]。另外，該材料較硬，給患者帶來不舒服，其來源主要靠進口，價格昂貴。這些因素在某種程度上限制PLGA在脂肪組織工程中的應用。近幾年，研究人員通過溶劑蒸發技術在PLGA中加入三磷酸鈉（TPP），不僅能降低pH，而且能促進干細胞在該支架上增殖，該技術將更促進PLGA的臨床應用[15]。

2.1.2 HYAFF:透明質酸在組織工程領域占有很重要的地位。它存在于結締組織、關節滑液和眼睛玻璃體中。在很多生物過程中起著重要作用，如組織水合作用、細胞分化、細胞行為和組織修復。HYAFF 是通過透明質酸和苯甲醇酯化形成的。HYAFF具有良好生物相容性、完全可降解性、水穩定性等特性，是一種很有潛力的支架材料，它可以加工生產出很多生物相容性好的材料，比如導管、膜、紗布、海綿等[16]。人肝細胞、皮膚成纖維細胞、角質細胞、軟骨細胞、雪旺氏細胞、骨髓間充質干細胞和脂肪組織源性間充質干細胞已成功地在這些模型進行培養。海綿支架作為構建組織工程脂肪的支架，具有免疫原性較低，可促進細胞一支架復合物血管形成等優點，但其最大缺點則為它不利于前脂肪細胞的分化成熟，故也限制了其在脂肪組織工程研究中的應用。

2.2 天然來源材料

2.2.1 膠原：膠原不僅可以做組織支持物，而且是細胞外基質的重要組成成分，它表現很好的細胞親合力。Itoi等[17]發現型膠原海綿與PLGA和透明質酸凝膠相比，它是最適合做脂肪組織工程的支架材料。但是由于它具有免疫原性、機械性能差、易于變形、花費高，所以難以獨立構成三維支架。

2.2.2 蠶絲:蠶絲作為一個天然高分子，有較好的機械性能和良好的生物相容性[18]。蠶絲是由絲素蛋白（約75%以上）和絲膠蛋白（約25%）構成[19]。可通過化學和物理方法，去除絲膠蛋白成分，從而達到調整蠶絲的機械強度。絲素蛋白具有良好的生物相容性，手術縫合線可證明它的性能。3T3-L1前脂肪細胞能在蠶絲支架上很好地吸附，并表現出正常的形態和功能。劉毅等[20]研究發現，50 um為構建組織工程脂肪時蠶絲蛋白支架材料的最佳孔徑。

2.3 微粒球:支架的形狀決定了再生組織的應用，從而孕育了可注射微球的理念。前脂肪細胞和脂肪細胞以凝膠的形式注入，由于缺少足夠的細胞粘附面積導致注入受限。針對以上原因，Burg等[21]發明了被水凝膠包裹的微粒球，可以被注入，脂肪細胞最終得到生長。動物實驗模型中，微粒球和凝膠的聯合適合脂肪組織再生，微粒球的不同構成會影響細胞粘附、基因表達、前脂肪細胞脂滴的形成。Masude等[22]利用含有豐富的血管和脂肪組織的網膜的碎裂組織包裹前脂肪細胞并植入小鼠體內，發現前脂肪細胞能在種植處產生脂肪組織。促進脂肪再生的另一種完全不同的方式是通過注入前脂肪細胞和細胞生長因子，促進前脂肪細胞遷移到靶目標后增殖再生脂肪組織。在小鼠基底膜注入前脂肪細胞和堿性成纖維細胞生長因子，注射部位的脂肪墊可觀察到脂肪再生。這種再生脂肪很可能是前脂肪細胞和內皮細胞遷移造成的，該方法仍有待進一步的研究[23]。

3微環境

細胞能在體內生長增殖，是由各種細胞因子和氧濃度調節完成的，因此兩者均很重要。

3.1細胞因子:運用足量的生長因子可促進組織工程化脂肪的形成，應用生長因子的類型分體內與體外兩種。體外培養中，應用一些生長因子是極有必要的，因為糖皮質激素、胰島素、胰島素增敏劑[24]、三異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、Asc-2-P、bFGF-2等生長因子能促進間充質干細胞分化。體內應用具有可選性，可能會加速組織工程化脂肪的形成。

組織工程化脂肪移植到受者體內，早期處于缺血狀態，待新生血管形成后，才能建立血液循環。故研究在組織工程中加入與血管生成相關的生長因子，可以增強組織工程化脂肪的血管化，加速血液循環的建立，減少脂肪細胞的壞死和吸收。這些因子主要有：血小板衍生生長因子（PDGF）、血管生成素-1（Ang-1）、轉化生長因子-β（TGF-β）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、血管內皮生長因子（VEGF）等。VEGF 和Ang-1分別對血管生成的不同時期起作用，并且形成的血管紊亂，不穩定[25]。VEGF 和胰島素樣生長因子-1共同作用能形成比較穩定的血管結構[26]；PDGF、TGF-β和Ang-1均起穩定血管的重要作用。純化的血管生成相關因子因體內半衰期短，不能起到理想效果，通過轉基因技術，可使他們有效而持續地表達。但如果不嚴格控制每個細胞周圍的微環境，就有可能誘導異常血管及血管瘤的產生。為了使該技術得到臨床運用，研究人員發明了一種以流式細胞分流儀為基礎的高通量方法來確定轉基因在轉基因細胞的表達水平，從而快速去除異常細胞，純化正常表達的細胞[27]。該技術成功地使轉有VEGF的成肌細胞在體內骨骼肌里形成豐富的血管網，避免異常血管的產生。細胞和基因治療相結合法為組織工程的高效植入提供了一個新的思路。Lin等[28]成功轉導Pdx1基因到ADSC，得到穩定產生胰島素的細胞。研究表明：轉染VEGF165基因的ASCs能夠大量、穩定且持續較長時間分泌VEGF，能為血管形成提供豐富穩定的血管生成因子，有促進工程化脂肪組織的血管化的作用，具有向內皮細胞分化的潛能，參與血管形成，使得內皮細胞需要的數量相對減少，脂肪組織工程在臨床上應用的可能性增加。

3.2氧分壓:研究人員30年前就開始研究造血系統中氧分壓對干細胞的生理影響。實驗研究中體外進行細胞培養的氧濃度大多數在20%左右，然而天然的內環境細胞的氧濃度往往要低很多：如動脈平均氧分壓為12%[29]。檢驗一位志愿者的骨髓抽取液時，發現樣本處于低氧狀態，濃度大約在1%～2%[30]。盡管脂肪組織血管豐富，但是在小鼠體內的脂肪細胞氧濃度只有3%左右[31]。故成人脂肪干細胞同樣處于低濃度氧狀態。最直接的證據可以來源于造血干細胞，它與骨髓間充質干細胞處于同一微環境當中[32]。有研究表明：低濃度氧的骨髓間充質增殖數目是正常氧濃度的30倍[33]；胚胎干細胞能在低氧下保持未分化狀態長達4周，保持其全能性長達18個月[34]；骨髓間充質干細胞在氧濃度2%培養下，持續表達胚胎干細胞標志OCT-4長達6周[35]。所以，低濃度氧可以增強多種干細胞及祖細胞的增殖能力，同時抑制分化，維持其多能性。Valorani等[36]研究發現鼠的脂肪間充質干細胞在低氧下培養，Sca-1/CD44表達增加，增殖數量增加，分化潛能被抑制，轉移到正常氧濃度培養，成脂分化能力明顯增強。亦有研究表明低氧濃度對分化成其他特定的細胞株有積極作用，尤其是軟骨細胞和心肌細胞[37]。Fink等[38]認為1%氧濃度能誘導骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化，無脂肪特定的基因表達增加；然而Lee等[39]認為2%氧濃度能抑制脂肪干細胞的成脂分化。促進干細胞分化與保持其多能性的最適宜氧濃度至今尚未知。低氧還可通過調節干細胞向內皮細胞的分化和生長因子分泌水平，從而影響工程化脂肪的血管化。在低氧的刺激下，成人脂肪間充質干細胞分泌的VEGF增加5倍[40]。一些體外研究也證明了骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞在低氧期間均有VEGF表達的上調。

4脂肪組織工程的臨床應用和展望

研究者們不斷采取多種有效方法使脂肪組織工程有了很大發展，如建立3D支架結構，各種支架材料最適孔徑，轉導血管生長因子，制造血管類似物，尋求和制造新的生物聚合物材料，動態培養及不斷更換培養基等。要讓組織工程化的脂肪組織更好地應用于臨床，需移植物有很好的血管化，才能保證形態和功能的維持。細胞歸巢技術可誘導相關干細胞向特定的生理解剖位置轉移，增殖和分化脂肪組織，彌補壞死吸收的損失。隨著科學的發展，各種知識的升華，必將把上述問題予以解決，相信組織工程化脂肪最終將廣泛應用于臨床，為軟組織修復帶來更好的明天。

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[收稿日期]2011-04-20 [修回日期]2011-05-31

編輯/李陽利