反義結締組織生長因子對人瘢痕疙瘩成纖維細胞的作用

[摘要]目的： 研究結締組織生長因子(CTGF)反義寡核苷酸(ASODN)對人瘢痕疙瘩成纖維細胞CTGFmRNA的表達和細胞增殖及膠原合成的影響，探討瘢痕疙瘩的基因治療。方法：體外分離、培養人正常皮膚成纖維細胞(NSF)和瘢痕疙瘩成纖維細胞(KF)，以脂質體介導方法將CTGFASODN轉染KF中，用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法檢測細胞中CTGFmRNA的表達；采用MTT方法測細胞增殖；3H-脯氨酸摻入法檢測細胞的膠原合成量。 結果：CTGFmRNA在NSF中幾乎無表達，在KF中表達增高，CTGFASODN可以抑制其增殖和膠原合成(P<0.05)。結論：CTGFASODN能夠抑制成纖維細胞CTGFmRNA表達和細胞增殖及膠原合成，表明阻斷CTGF可能是延緩瘢痕纖維化的有效手段。

[關鍵詞]結締組織生長因子；反義寡核苷酸；瘢痕疙瘩

[中圖分類號]R619+.6[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）06-0936-03

Effects of connective tissue growth factor antisense oligonucleotides on the cultured human keloid fibroblasts

REN Li-hong1， DUAN Guo-xin2， YANG Da-ping1， LIU Ying1， XIAO Zhi-bo1， TENG Wen1， LIU Guo-feng1

（1.Plastic Cosmetic Center，The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China; 2.Department of Plastic Surgery，Shengmeijia Plastic Surgery Clinic，Shenzhen 518000，Guangdong，China）

Abstract:ObjectiveTo explore the effects of connective tissue growth factor(CTGF) antisense oligonucleotides on the expression of CTGF mRNA， cell proliferation and collagen synthesis in the cultured human keloid fibroblasts. MethodsNormal skin fibroblasts(NSF) and keloid fibroblasts(KF) were cultured in vitro， CTGF antisense oligonucleotides were transfected into the KFs by liposome. The expression of CTGFmRNA was assessed by reverse transcription polymerase chain reaction method(RT-PCR).Cell proliferation was detected by MTT method and the collagen synthesis of KF was assessed by 3H-proline incorporation method.ResultsCTGFmRNA was strongly expressed in KF(P<0.05)， whereas it was not expressed in NSF. CTGF antisense oligonucleotides could inhibited CTGFmRNA expression， cell proliferation and collagen synthesis.ConclusionsCTGF antisense oligonucleotides could inhibited the expression of CTGFmRNA， cell proliferation and collagen synthesis， implying that CTGF may be a potential therapeutic target to scar fibrosis.

Key words: connective tissue growth factor; antisense oligonucleotides; keloid

瘢痕疙瘩(Keloid)是以成纖維細胞為主的細胞成分過度增殖和以膠原為主的細胞外基質過度沉積的皮膚纖維化疾病[1]，目前其發病機制尚不十分清楚。結締組織生長因子(CTGF)是轉化生長因子β1(TGF-β1)的下游效應因子，是一個重要的促纖維化細胞因子[2]，其過度表達與某些纖維化性疾病的發生、發展密切相關，如硬皮病、腎纖維化、肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化等[3-4]。

反義寡核苷酸能以序列特異方式抑制基因表達，在治療癌癥、微生物感染、自身免疫病等方面取得了可喜成績。本研究通過體外培養人瘢痕疙瘩成纖維細胞(KF)觀察CTGF反義寡核苷酸（ASODN）對CTGFmRNA的表達，成纖維細胞增殖及膠原合成的影響，探討CTGF在瘢痕纖維化中可能的作用。

1材料和方法

1.1標本取材：取自哈醫大二院整形美容科手術標本，包括正常皮膚4例，瘢痕疙瘩10例。男8例，女6例；年齡16～37歲；瘢痕增生的時間在3～6個月。

1.2試劑和材料：RPMI1640培養液、新生胎牛血清（美國Hyclone公司）；Dotap脂質體（美國Biontex公司）；TRIzol Reagent、 RT-PCR試劑盒（美國Invitrogen公司）；MTT（美國Sigma公司）；3H-脯氨酸（中國原子能核物理所）；液閃測定儀（美國Beckman公司）。

1.3CTGF ASODN的合成：CTGF反義寡核苷酸堿基序列為：5，-TACTGGCGGCGGTCAT-3，[5]，實驗前進行全硫代化修飾及5，-異硫氰酸熒光素(FITC)標記，由上海生工生物工程公司合成。

1.4組織塊成纖維細胞培養：將手術中切下的正常皮膚、瘢痕疙瘩組織在無菌條件下去除表皮后用PBS漂洗3次，用眼科剪剪成約1mm3的碎塊，采用組織塊貼壁法培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，置37℃，5%CO2條件下原代培養。每2天換一次培養液。待細胞接近80%融合時，經0.25%的胰蛋白酶消化傳代。在傳代至3～5代時進行分析。實驗分三組：①正常皮膚成纖維細胞(NSF)；②瘢痕疙瘩成纖維細胞(KF)；③KF+CTGF ASODN。

1.5細胞轉染：采用無血清、無抗生素的RPMI1640培養液分別稀釋CTGF ASODN和Dotap脂質體，室溫下靜置30min后等量混勻，即形成反義ODN-脂質體復合物。向第3組滴加入ASODN-脂質體復合物(兩者終濃度為20μg/ml[5])繼續培養，胎牛血清的體積分數改為5%，其余條件同前。

1.6逆轉錄-聚合酶鏈式反應：于轉染后48h按照TRIzol說明書在培養瓶中提取總RNA，1%甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA樣本的完整性良好，并用RNA/DNA計算器檢測RNA的濃度。取RNA2.0μg作逆轉錄，反應條件為70℃10min，37℃60min，99℃5min.取1μl逆轉錄產物為模板，三磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)為外參照，將CTGF與G3PDH同等條件擴增。預期CTGF的擴增片段長度微766bp，上游引物為5，-GCCCAGACCCAACTATGA-3，下游引物為5，-ACCCTCCCAC TGCTCCTA-3，；G3PDH的擴增片段長度為450bp，上游引物為5，-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物為5，-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3，。反應條件為：94℃預變3min、94℃變性40s、56℃退火 40s、72℃延伸40s，共循環30次，72℃延伸10min。取PCR產物5μl在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統觀察結果并照相，用計算機圖象處理系統分析，計算目的基因、G3PDH基因條帶相對吸光度。

1.7MTT法測成纖維細胞增殖每孔5×103個細胞接種于96孔培養板上，每組做三孔，取平均值。分別于轉染6、12、24、48、72h取出一塊培養板，用MTT法測定各孔光吸收值，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.83H-脯氨酸摻入法測成纖維細胞膠原蛋白合成：瘢痕疙瘩成纖維細胞1×104個/孔分種于24孔培養板上，于轉染48h后吸棄上清液，加入3H-脯氨酸繼續培養10h，多孔收集器收集細胞于玻璃纖維紙上，液閃測定儀閃爍記數測定3H-脯氨酸摻入量。每組設3個復孔。

1.9統計學分析：采用SPSS 10.0統計軟件包，對各實驗組數據進行單因素方差分析。

2實驗結果

2.1 逆轉錄-聚合酶鏈式反應結果：CTGFmRNA在NSF組中表達極弱，在KF中表達增強，ASODN組CTGFmRNA表達減弱(圖1)。CTGFmRNA的表達量經方差分析，CTGF ASODN組表達量（0.28±0.62）顯著低于KF組（0.74±0.16），差異有顯著性意義（P<0.05）。

2.2 CTGFASODN對成纖維細胞生長曲線的影響：NSF組、KF組曲線逐漸升高，其中KF組升高幅度明顯大于NSF組；而KF+CTGFASODN組在轉染后第6h生長曲線明顯呈下降趨勢，至72h降至最低（見圖2）。

2.3 CTGFASODN對KF膠原合成的作用：利用3H-脯氨酸摻入，在無血清培養的條件下，觀察CTGFASODN對KF膠原合成的影響。其中，KF組中膠原合成量（5891±182）明顯較NSF組（1367±218）增多 (P<0.05)；而CTGFASODN對KF膠原合成（3487±629）有明顯抑制作用，差異有顯著性意義(P<0.05)。

3討論

在許多纖維化疾病中CTGF與TGF-β1的表達同步增高[6]。Grotendorst等[7]發現，在CTGF啟動子-162～-128核苷酸序列中有一個TGF-β1反應元件，其點突變可以導致TGF-β1活性完全喪失，故認為CTGF是TGF-β1致纖維化作用的直接下游效應介質。

反義寡核苷酸技術是根據核酸間結合需遵循堿基互補原則這一原理，使用與目的基因特定互補的短核苷酸片段阻斷目的基因的表達。脂質體具有安全、高效、使用方便和無免疫原性等優點，可以使細胞攝取寡核苷酸的能力增加10～20倍。

研究結果顯示，從mRNA水平看，CTGF在正常皮膚成纖維細胞中表達極其微弱，在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達增高，因此我們推測在瘢痕疙瘩纖維進程中，可能伴隨著CTGF DNA向mRNA轉錄過程的啟動以及高水平轉錄的持續存在，進而翻譯成CTGF蛋白質，后者發揮生物學活性刺激組織中成纖維細胞增殖和外基質合成增加，增殖的成纖維細胞又產生更多的CTGF，這樣惡性循環，最終形成大量的纖維化組織，導致瘢痕形成。

MTT是一種淡黃色唑氮鹽，是線粒體脫氫酶的作用底物，經活細胞內線粒體脫氫酶的消化作用，被還原成不溶于水的藍紫色form azan的結晶。結晶溶解后，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定光吸收值，來反映細胞的增殖能力和存活情況。體外培養的KF的MTT生長曲線結果顯示CTGFASODN能明顯抑制瘢痕成纖維細胞的增殖活性，表現為生長曲線逐 漸下降。

膠原蛋白是細胞外基質中最活躍的成分之一，是創面愈合和瘢痕形成的關鍵因素，膠原蛋白的異常合成與沉積是病理性瘢痕的基礎。可以通過檢測3H標記的脯氨酸摻入膠原的量來分析膠原合成速度，3H-脯氨酸摻入結果顯示，CTGFASODN能夠抑制體外培養的KF合成膠原。

由于RT-PCR證實ASODN轉染后KF中CTGFmRNA表達水平較KF降低，證明CTGFASODN抑制KF增殖并抑制其膠原合成，均是由于其有效的抑制了KF內CTGF的基因轉錄，說明CTGF ASODN成功地發揮了其反義抑制作用。

許多年以來， TGF-β1被認為是促進瘢痕纖維化的最重要的生長因子之一[8]，但他同時也是一種有效的免疫調節劑，具有抗炎等重要生物學活性，研究表明新生小鼠敲除TGF-β1基因，在出生后很快死于全身炎癥，鑒于TGF-β1作用的靶細胞種類繁多、生物學效應復雜，因此完全阻斷其表達或活性的后果是難以預料的[9-11]。相比之下，CTGF作為TGF-β1的下游效應因子，特異性介導TGF-β1的促纖維化效應，因此，阻斷CTGF的生物學效應可能是一條相對安全的延緩瘢痕纖維化的新途徑。

[參考文獻]

[1]Frank B，Niessen MD，Paul HM， et al. On the nature of hypertrophic scars and keloids: A review[J].Plast and Reconstr Surg，1999，104(5):1435-1449.

[2]Goldschmeding R，Aten J，Ito Y，et al. Connective tissue geowth factor: just another factor in renal fibrosis[J]? Nephrol Dial Transplant，2000，15(3):296-299.

[3]Leask A，Holmes A，Abraham DJ. Connective tissue growth factor : a new and important player in the pathogenesis of fibrosis[J].Curr Rheumatol Rep，2002，4(2):136-142.

[4]Kucich U，Rosenbloom JC，Herrick DJ，et al. Signaling events required for transforming growth factor-beta stimulation of connective tissue growth factor expression by cultured human lung fibroblasts[J].Arch Biochem Biophys，2001，395(1):103-112.

[5]Hishikawa K，Oemar BS，Nakaki T.Static pressure regulates connective tissue growth factor expression in human mesangial cells[J]. J Biol Chem， 2001，276(20):16797-16803.

[6]Chen MM， Lam A， Vidaud M， et al. CTGF expression is induced by TGF-β1in cardiac fibroblasts and cardiac myocytes: a potential role in heart fibrosis[J]. J Mol Cell Cardiol，2000，32(10):1805-1819.

[7]Grotendorst GR，Okochi H，Hagash N，et al. Role of connective tissue growth factor in fibronectin expression and tubulointerstitial fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol，2002，282(5):933-942.

[8]郝立君，李宜姝，段國新，等. 抗轉化生長因子β1預防和治療瘢痕疙瘩的研究[J].實用美容整形外科雜志，2003，14(5):271-274.

[9]Colwell AS，Phan TT，Kong W，et al. Hypertrophic scar fibroblasts have increased connective tissue growth factor expression after transforming growth factor-beta stimulation[J].Plast Reconstr Surg，2005，116(5):1387-1390.

[10]Wang S，Hirschberg R.BMP7 antagonized TGF-β-dependent fibrogenesis in mesangual calls[J].Am J Physiol Renal Physiol，2003，284(5):1006-1013.

[11]Zhang C，Meng XF，Zhu ZH，et al. Role of connective growth factor in plasminogen activator inhibitor-1 and fibronectin expression induced by transforming growth factor beta1 in renal tubular cells[J]. Chin Med J，2004，117(7):990-996.

[收稿日期]2011-03-26 [修回日期]2011-05-16

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、公式、注解等請以PDF格式閱讀”