運動性骨骼肌損傷相關指標的實驗研究

摘要：探討血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)以及波形蛋白(Vimentin)與骨骼肌損傷的關系，將50只8周齡SD大鼠隨機分為安靜組(C)和運動組(B₁，B₂，B₃，B₄)，運動組進行重復3d的力竭性離心運動，電鏡和光鏡檢測骨骼肌損傷病理生理變化，分光光度法檢測大鼠血清CK、LDH的變化和免疫組化檢測波形蛋白的表達。結果顯示：1)血清CK、LDH出現時程變化，并與骨骼肌損傷出現了一致性；2)波形蛋白免疫反應分值呈現時程性。結論：1)CK可作為骨骼肌損傷的間接指標；2)波形蛋白的表達暗示著骨骼肌損傷后的再生。

關鍵詞：運動性骨骼肌損傷；肌酸激酶；乳酸脫氫酶；波形蛋白；時程

中圖分類號：G804.53 文章編號：1009-783X(2011)02-0184-04 文獻標志碼：A

在運動實踐中，由于肌肉活檢的限制，常用骨骼肌損傷的一些間接指標來反映肌細胞損傷程度，例如，血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶、肌紅蛋白以及與炎癥反應有關的蛋白(如急相蛋白)和炎癥過程指標物等。近年來，結蛋白和波形蛋白的發現為肌肉病理研究開拓了一個新的領域，但是這些指標與運動性骨骼肌損傷的關系有不同的說法，本文通過對大鼠運動性骨骼肌損傷的直接測定和間接指標測定，從而探討這些間接指標與骨骼肌損傷之間的關系。

1 材料與方法

1.1實驗對象及分組

健康成年8周齡雄性(sprague-dawley，SD)大鼠50只，體重(212.55±15.74)g(購自湖南農業大學動物中心，許可證號：湘scxk 2003－003)，為清潔級實驗動物。以國家標準嚙齒類動物飼料分籠飼養，自由飲食和飲水。適應喂養3d后，進行一次5～10min跑臺運動適應性訓練(速度為16m／min，坡度為0°)。隨機分成對照組(A)和運動后即刻(B₁)、運動后3h(B₂)、運動后24h(B₃)和運動后48h組(B₄)，每組10只大鼠。實驗期間室溫為20～25℃，相對濕度為45％～55％，自然晝夜節律變化光照。

1.2實驗動物運動方案

運動組大鼠進行3d的運動跑臺適應性訓練(速度為16m／min，坡度為16°，時間為5～10min)后，休息2d，正式開始實驗，力竭模型采用跑臺運動，速度為16m／min，坡度為16°，持續運動至力竭。運動中采用聲、光刺激或毛刷機械刺激鼠尾部，或中間適當休息2～4min，當動物出現臥位跑、反應遲鈍，“逃避反應”極差，短時間休息后(低于10min)仍無法持續運動，則視為力竭。

1.3標本制備

實驗運動方案結束后，用0.1％戊巴比妥鈉1mL／100g腹腔注射進行麻醉。眼球取血1.5mL于離心管中，將血樣離心(4℃，3000r／min，10min)分離血清，血清于－80℃低溫冰箱貯存待測。迅速取右前肢肱三頭肌內側頭下端肌腱和肌腹交界處取約1.0mm×1.0mm×0.2mm標本放入4℃預冷的生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干肌肉組織表面水分，置于4％多聚甲醛溶液中固定24h，4℃冰箱保存，進行常規石蠟包埋。在每組10只動物中隨機取1只右前肢肱三頭肌內側頭下端0.5mm×0.5mm×0.2mm標本放入2.5％戊二醛中固定，以備透射電鏡制備。

1.4指標測試

1.4.1透射電子顯微鏡觀察骨骼肌損傷

透射電子顯微鏡主要觀察骨骼肌組織的結構有：縱切面上肌原纖維、肌節排列的規則程度，A、I帶完整情況和位置關系；肌膜、肌核、形態等。主要定量觀察z線模糊、z線波紋狀改變、Z線流!z線局灶性溶解、斷裂和消失任一種情況者均稱為z線異常，并統許Z線異常百分數。

1.4.2光鏡下觀察骨骼肌損傷

光鏡主要觀察骨骼肌組織的結構有肌外膜、肌核、肌纖維的形態及肌間質小血管、炎性細胞等，并統計細胞結構異常率。

1.4.3CK、LDH的測定

CK、LDH(試劑均產自南京建成)活性采用分光光度法測定。

1.4.4用免疫組織化學方法測定波形蛋白表達

免疫化學方法嚴格按試劑盒(美國SantaCruz公司)說明書操作，用麥克奧迪顯微分析圖像系統分析。每組選片4張，每張切片鏡下(×400)隨機取5個視野進行分析，陽性物質用光密度值和陽性表達面積表示，前者代表陽性區域波形蛋白的含量，即波形蛋白表達的程度，它的升高和降低反映了運動后不同的時間段各自表達程度的改變，從而間接反映骨骼肌微損傷和再生的變化情況，后者表示波形蛋白表達的范圍，則比較直接地反映骨骼肌微損傷和再生的變化情況。

實驗結果的分析以平均光密度值，陽性面積百分比和免疫反應分值作為評價指標進行半定量，來了解波形蛋白的表達規律。采用一定面積中光密度值與陽性面積的乘積作為免疫反應分值(immunoreactive8core，IRS)，即免疫反應分值一陽性強度光密度值×陽性染色區域的面積。

2 實驗結果

2.1肌肉損傷的形態學觀察

2.1.1肌肉組織電鏡觀察結果

對照組c縱切片可見肌節結構完整、形態基本正常。肌原纖維排列緊密，A帶、I帶、H帶和M線清晰、完整，規律性交替排列呈明暗相間的橫紋，z線清晰、完整，偶見局部出現異常，例如流變等(極少)。肌膜完整，肌核大小正常，核膜光滑、完整。線粒體大小正常、包膜及嵴完整，并均勻分布于肌漿中(如圖1－C所示)。運動后即刻B₁組可見有A帶、I帶；z線斷裂；肌細胞腫脹，肌膜呈指狀突起；線粒體數目增多、稍腫脹，有明顯的超微結構損傷，屬于局灶性損傷(如圖1－B₁所示)。運動后3h組隱約可見A帶、I帶；z線彎曲，變形，肌原纖維呈玻璃樣溶解；肌細胞腫脹，肌核固縮，肌膜皺縮；線粒體腫脹、嵴紊亂、出現空泡變性屬于嚴重損傷(如圖1－B₂所示)。運動后24h組可見有明顯的超微結構損傷，程度比運動后3h組明顯地嚴重，屬于非常嚴重損傷，A帶、I帶、Z線都溶解；肌細胞腫脹，肌膜皺縮，表面有指狀突起，部分與基膜分離，甚至有肌膜溶解；肌核腫脹.固縮，線粒體腫脹、嵴紊亂、出現空泡變性(如圖1－B₃所示)。運動后48h可見超微結構損傷減輕，程度介于嚴重損傷與非常嚴重損傷之間。部分A帶、I帶和z線可以分辨；肌細胞腫脹，肌膜皺縮；肌核腫脹，固縮；線粒體腫脹、嵴紊亂(如圖1－B₁所示)

2.1.2肌肉組織光鏡觀察結果

對照組縱切片可見長柱形的多核肌細胞排列緊密、明暗相間的橫紋清晰、規則重復排列，肌漿周邊(肌膜)下可見核呈扁橢圓形，大小正常，異染色質較少、染色較淺。橫切片可見肌細胞呈多角形巢形分布，大小正常，肌核分布于肌漿周邊(肌膜)下，未見腫脹、固縮。肌間質未見明顯的血管改變和炎性反應。運動后即刻組部分肌質小血管出現擴張，血管內血栓形成，并伴有極少量的炎癥細胞浸潤出現，肌細胞核分布不均，肌細胞腫脹等現象。運動后3h組這種肌腫脹現象減小。運動后24h骨骼肌細胞組織形態結構的異化程度達到最大。運動后48h，這種骨骼肌細胞組織形態結構有所恢復，肌纖維腫脹現象明顯減少，炎癥細胞浸潤較多。這些結果說明了離心運動對骨骼肌微細結構的影響具有延遲性，這種組織形態結構的改變在運動后24h～48h間最為嚴重。

2.2CK、LDH的測定

2.2.1血清中肌酸激酶(CK)的時程變化(見表2)

連續3d力竭性離心運動后，血清肌酸激酶的活性相對運動前有所升高，運動后即刻血清肌酸激酶升高不顯著，在運動后3h，血清肌酸激酶升高至運動前的2.2倍，而在運動后24h，血清肌酸激酶的活性達到峰值，升高到運動前的5.4倍。而在運動后48h，肌酸激酶的活性又恢復到安靜狀態。

2.2.2血清中乳酸脫氫酶(LDH)的時程變化(見表2)

經過連續3d力竭性離心運動后，運動后即刻血清乳酸脫氫酶的活性較運動前有很大的提高，增加到(9276.20±1380.66)U／L，與運動前的(5997.35±616.76)U／L相比，具有非常顯著性差異(P<0.01)，運動后3h與運動后即刻相比乳酸脫氫酶活性沒有統計學差異(P>0.05)，運動后24h達到峰值，此時LDH活性增加到(9555.56±888.25)U／L，到運動后48h又恢復到運動前的水平。

2.3大鼠骨骼肌波形蛋白表達的時程變化

對照組無論是平均光密度值還是陽性目標面積都有很少的表達。運動后即刻組大鼠骨骼肌波形蛋白表達的平均光密度值最高，說明此時表達信號最強；運動后3h波形蛋白表達強度明顯低于運動后即刻組(P<0.05)，但仍明顯高于對照組(P<0.05)；運動后24h，48h組表達強度低于運動后3h組，但差異沒有統計學意義，與對照組也沒有顯著差異(見表3)。

運動后即刻組和運動后3h組波形蛋白表達面積高于對照組(P<0.05)，但是低于運動后24h組和48h組(P<0.05)。運動后24h和48h組表達面積沒有顯著性差異，但都明顯高于對照組(P<0.01)，這2個時相中波形蛋白表達面積最大(見表3)。

運動后所有時相的免疫反應分值都明顯高于對照組。運動后24h時相大鼠骨骼肌中免疫反應分值最高(見表3)。

從各組平均光密度值和陽性面積來看，B₁組平均光密度最大，以后逐漸減少。而陽性面積從運動后即刻開始逐漸遞增，B₃、B₄組的陽性面積最大。免疫分值在運動后24h，但是運動后即刻也較高，說明運動后不同時相波形蛋白有一定的表達。

3 討論

3.1骨骼肌組織形態學的變化

以往的跑臺運動致大鼠骨骼肌損傷模型都是采用一次性下坡跑訓練方式。取材部位都是后肢，例如，比目魚肌、腓腸肌、脛骨前肌、股四頭肌等，但是運動在下坡跑過程中，肌肉抵抗體重形成的運動負荷進行離心收縮，最主要的工作肌群是前肢的肌四頭肌、小腿三頭肌，而對其后肢，由于體重的分布原因，作用效果小。本實驗取材選取大鼠前肢肱三頭肌長頭下端，實驗結果發現大鼠經過連續3d力竭性離心運動后骨骼肌組織形態學發生了損傷，而且損傷發生的趨勢是運動后即刻損傷程度較小，運動后3h，運動后24h損傷程度遞增，運動后即刻損傷主要表現在肌細胞腫大，肌核分布不均，以后隨著恢復時間的延長，炎癥細胞浸潤逐漸增加。

3.2血清CK、LDH在重復3d離心運動后的時程變化

血清肌酸激酶是血漿非功能性酶的一種，正常時血清中肌酸激酶主要來自骨骼肌，其濃度相對穩定。運動后，由于運動引起人體內環境的急劇變化，尤其是運動導致的骨骼肌細胞膜結構和功能的變化，血清中肌酸激酶會升高。CK常用來作為骨骼肌微損傷和延遲性肌肉酸痛出現的一個間接指標。

離心收縮能導致運動后血清CK活性水平的最大增加，峰值大約出現在運動后24～48h甚至更晚，延續時間長達幾天。Armstrong發現離心性活動(下坡跑)可導致大鼠血清CK活性在運動后呈雙相變化，即運動后酶活性迅速升高，6～12h基本恢復正常，36h后再次出現高峰，并且血清CK活性第2次增加的程度更為顯著。他認為造成這種現象的原因是由于離心性運動的牽拉作用導致了肌肉組織的嚴重損傷，從而引起部分肌好維變性壞死后使肌肉酶釋放的結果；但是近來的研究表明，血清肌酸激酶在一次性離心運動至力竭不同恢復時間內，血清肌酸激酶峰值出現在運動后即刻，運動后1d迅速下降。本實驗的研究發現，運動后即刻，CK活性明顯升高，在運動后24h達到峰值，以后逐漸恢復，與田野等人的研究結果一致，因此，血清CK活性的變化與骨骼肌組織細胞損傷率以及延遲性肌肉酸痛都具有延遲性一致。

LDH普遍存在于全身各組織細胞，尤以肌肉細胞為甚，它是機體糖酵解供能系統的關鍵酶之一，對機體缺氧狀態下運動時能量的生成、供應及乳酸代謝有著十分重要的意義。Arm-strong的研究表明，大強度運動后血漿LDH活性顯著升高，并與骨骼肌超微結構變化一致。而于新凱、許敬等人的研究結果是運動后即刻乳酸脫氫酶的活性最高，以后逐漸恢復。本實驗結果發現，連續3d力竭性離心運動后不同恢復時間乳酸脫氫酶活性出現雙相增高現象，即運動后即刻和運動后24h2個高峰時期，這與王建芳、Armstrong等的研究結果一致。在CK和LDH這2種酶中，CK活性與骨骼肌組織細胞損傷率更為符合。

3.3波形蛋白表達的時程變化

細胞骨架分為3種蛋白質纖維，即微絲、微管和中等纖維。中等纖維在細胞質內形成一個完整的支撐網架系統，它在外面與細胞膜和細胞外基質直接聯系，在內部與核表面和核基質直接聯系，中間與微絲、微管及基質細胞器結合；因此，在細胞內和細胞間起著多方面的結構作用，波形蛋白是中等纖維的主要成分之一，在細胞的完整性和細胞骨架的穩定性中發揮作用。運動與波形蛋白的研究目前較少，Liebe等發現離心運動30min后兔趾長伸肌和脛骨前肌Desmin表達下降，Vimentin和Titin的表達已經開始增加。我國學者段立公等利用兔重復跑跳制造損傷模型后發現結蛋白和波形蛋白陽性部位組織在組織學及超微結構中都表現為肌纖維的損傷和再生的病理改變。

本實驗發現，對照組正常骨骼肌胞漿的棕褐色陽性反應呈網狀均勻分布，染色較淺，胞核蘇木精復染呈藍色。運動后即刻組染色程度明顯加深，而且陽性范圍明顯增大，不僅分布于細胞周圍結締組織，以及小血管的周圍及內部，也分布于胞漿中。運動后3h，骨骼肌細胞中波形蛋白免疫組織化學染色范圍比運動后即刻更大，胞漿中表達較少，細胞間隙的周圍，尤其是小血管的周圍表達有明顯增多。運動后24h組的波形蛋白染色范圍最大，胞漿和細胞間隙染色范圍增大，但染色程度比運動后即刻和運動后3h組要淺。48h組染色范圍和運動后24h組范圍差不多，胞漿，細胞周圍已有小血管分布處都有表達，尤其在個別壞死細胞處整個細胞區域都有表達，表達程度比前面幾組都要淺。

有研究表明，許多組織可同時表達2種或2種以上的中間絲蛋白質，Vimentin通常是其中之一，說明Vimentin在細胞生長中可能起重要作用。在成人組織中，Vimentin與其他中間絲蛋白質共同表達時，常與細胞的增殖活躍有關。也有研究發現波形蛋白在注射蛇毒后12h激活的肌衛星細胞中存在，在肌肉再生的早期大量表達，2～3d達到頂點，波形蛋白在肌肉再生的早期肌衛星細胞的激活過程中發揮重要的作用。

本實驗也發現波形蛋白的陽性范圍的時程性變化是在運動后即刻較低，運動后24h達到最高，運動后48h與運動后24h也沒有差異。而光密度值卻呈現相反的趨勢，可能與運動后骨骼肌衛星細胞的增殖和分化有關。在重復3d離心運動后即刻，肌衛星細胞開始進入增殖期，此時波形蛋白表達強度最大，而運動后24h，肌衛星細胞已經分化了，所以，表達強度有所減弱。說明波形蛋白與衛星細胞有非常緊密的聯系，可作為骨骼肌再生的一個重要標志。

4 結論

1)CK可以作為骨骼肌損傷的間接指標。

2)波形蛋白的表達呈現出時程性變化，可作為骨骼肌損傷后再生的一個重要標志。