通過實驗讓學生理解影響凝膠過濾層析的因素

在生物化學實驗中，凝膠過濾層析，也稱分子篩層析、排阻層析，是以被分離物質的分子量差異為基礎的一種層析分離技術。筆者現將凝膠層析的用途及通過實驗讓學生理解掌握影響凝膠過濾層析的兩種因素闡述如下。

一、凝膠層析的應用廣泛

凝膠層析的應用非常廣泛，最主要的應用有以下四種。

1.脫鹽

高分子(如蛋白質、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析除去，這一操作稱之為脫鹽。

2.用于分離提純

凝膠層析已廣泛用于酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質的分離提純。凝膠對熱原有較強吸附力，可用于除去無離子水中的致熱原制備注射用水。

3.測定高分物質的分子量

用一系列已知分子量的標準品放入同一凝膠柱內，在同一條件下層析、記錄每一分鐘成分的洗膠體積;根據物質的洗膠體積，在標準曲線上查出其分子量。

4.高分子溶液的濃縮

二、通過葡聚糖凝膠柱層析實驗，讓學生理解影響凝膠過濾層析的兩種因素

學生通過實驗，掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。對于凝膠過濾層析的理論學習，學生普遍感到抽象、難理解。通過實驗，可以讓學生在實驗的過程中，變抽象為直觀，變難懂為易懂。在實驗開展的進程中，學生可以親眼觀察到凝膠的選擇和層柱大小、長短的不同均會對實驗結果產生影響。

1.凝膠的選擇，根據實驗目的不同，選擇不同型號的凝膠

目前，市售凝膠主要包括:價格便宜的凝膠葡聚糖G-10，分離范圍<700;價位適中的凝膠葡聚糖G-35，分離范圍是<5000;價格偏貴、膠位度較大的為凝膠葡聚糖G-35、G50，分離范圍分別為1000-17000及1000-30000。在該實驗中，樣品藍色葡聚糖2000分子量的約為2×105，而溴酚藍分子量約為670，兩者分子量相差較大，可選擇顆粒較大而膠聯度較小的、價格相對適中的凝膠葡聚糖G25。由于藍色葡聚糖分子量過大，不能從凝膠分子中通過，所以藍色葡聚糖2000克于溴酚藍出柱，從而達到分離、兩者分離的效果。

在實驗中，學生可以清楚地認識到:第一，選擇凝膠首先要根據樣品的情況確定一個適中的分離范圍，根據分離范圍來選擇合適型號的凝膠。如果分離范圍選擇過小，則某些組分不能得到分離;如果分離范圍選擇過大，則分離率較低，分離效果也不好。第二，選擇凝膠顆粒的太小。顆粒小，分辨率高，但相對的流速慢，實驗時間長，有時會造成擴散現象嚴重;顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當也可以得到滿意的結果。選擇時，要依據分離的具體情況而定。例如，樣品中各個組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，較快達到分離的目的;如果有個別組分差別較小，則要考慮使用小顆料凝膠以提高分辨率。

2.層析柱的大小、長短對分離結果的影響

在該實驗中，樣品量較小，只有0.6ml的混合樣，柱粗可采用1CM，再采用兩根長短不同的層析柱進行分離。對比兩者分離效果，層析柱1(1×20CM)，藍色葡凝糖2000和溴甲酚藍明顯在柱中分層，在540nm處吸光度檢查，分別在12管和26管出現峰值，說明兩者得到較好地分離。層析柱2(1×20CM):藍色葡聚糖2000和溴甲酚藍在柱中沒有出現明顯的分層，在540nm處吸光度檢查，在第8管和10管中出現相似的峰值，說明兩者出柱的時間較接近，難以分離。

另外，層析柱的長度對層析效果會產生直接影響。在實際的工作中，常常通過系統實驗來選擇規格適合的層析柱。為了滿足高分辨率的要求，通常采用L/D(長度/直徑)比值高的柱子。但是，增高柱長雖然能提高分辨率，但會影響流速和增加樣品的稀釋度。在該實驗中，由于葡聚糖2000和溴甲酚藍分子量差別較大，一般認為直徑與高度的比為1:20為宜，柱高以20cm為準。該柱高不但滿足兩種樣品的分離，柱上能表現明顯的分層，且能縮短分離時間。

(作者單位:海南省高級技工學校)