高效發(fā)酵木糖重組酵母菌株YPH499-CZ發(fā)酵條件研究

[摘要] 目的 對能夠高效利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的重組酵母菌株YPH499-CZ發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。方法 通過單因素實驗優(yōu)化發(fā)酵條件，考察多種營養(yǎng)元素以及培養(yǎng)溫度、發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值因素對重組酵母菌株發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇的影響。結(jié)果 在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯化鈣和硫酸銨能不同程度提高發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效率，添加磷酸二氫鈉效果不顯著，添加肌醇和植酸鈉在一定濃度范圍內(nèi)可提高重組菌株發(fā)酵效率，最佳發(fā)酵溫度30℃，最佳起始pH為5.5。結(jié)論 添加一定營養(yǎng)鹽可提高重組酵母菌株發(fā)酵效率。

[關(guān)鍵詞] 木糖發(fā)酵; 重組酵母菌株; 培養(yǎng)條件; 生長曲線

[中圖分類號] TQ92 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)15-11-03

隨著工業(yè)迅速發(fā)展、人口增長和人民生活水平的提高，能源短缺已經(jīng)成為世界性問題，能源安全受到各個國家的重視[1]。乙醇是一種重要的化工原料，可以添加到汽油中使用，也可以完全替代汽油充當(dāng)燃料，并且是一種完全清潔的能源，符合當(dāng)前環(huán)保理念，我國早在“十五”規(guī)劃中就制定了發(fā)展燃料乙醇的規(guī)劃[2]。目前乙醇主要由淀粉原料發(fā)酵制得，以糧食換取乙醇的方法無疑是一種巨大浪費，有些國家已經(jīng)明令禁止利用糧食生產(chǎn)乙醇，因此利用廉價易得的纖維素類物質(zhì)例如秸稈生產(chǎn)乙醇成為合理選擇。利用酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇已有多年歷史，然而普通釀酒酵母菌株不能利用木糖發(fā)酵，而木糖是木質(zhì)纖維素水解后的主要成份，我們用基因工程手段對釀酒酵母菌株進(jìn)行改造得到重組酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-CZ，其能夠利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，具有潛在的應(yīng)用前景。

目前已知的酵母菌有490余種，酵母具有個體大、蛋白質(zhì)含量高、雜食性強、易分離、易培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物多、綜合利用廣等特點，在現(xiàn)代工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。為了使重組酵母菌株YPH499-CZ得到進(jìn)一步應(yīng)用，須了解該酵母菌株生長特點，掌握其最佳生長條件。本文系統(tǒng)研究了多種營養(yǎng)元素對該菌株發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的影響，并且對其發(fā)酵最適溫度和最適起始pH值進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 菌株

重組酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-CZ由河北省藥物質(zhì)量研究室構(gòu)建并保存。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(YEPD培養(yǎng)基)(M/V):葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%;斜面培養(yǎng)基:YEPD培養(yǎng)基每升加瓊脂粉20g;木糖發(fā)酵培養(yǎng)基(M/V):木糖5%，蛋白胨3%，酵母粉3%。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

從斜面保存菌種接種于YEPD培養(yǎng)基，250mL搖瓶裝液量100mL，30℃ 180rpm培養(yǎng)24h作為種子;1%接種于木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，250mL搖瓶裝液量100mL，接種后30℃ 180rpm培養(yǎng)72h;測定木糖消耗與乙醇產(chǎn)量。

1.4 乙醇含量分析測定方法

乙醇濃度利用SBA生物傳感分析儀測定(山東省科學(xué)院生物研究所)。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

分別考察額外添加無機鹽:氯化鈣、硫酸銨、磷酸二氫鈉以及外加肌醇和植酸鈉對重組酵母菌株發(fā)酵生產(chǎn)乙醇性能的影響，并對發(fā)酵培養(yǎng)基最適起始pH值及培養(yǎng)溫度的選擇進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 生長曲線測定

在一定的范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與光密度(OD值)成正比，因此通過測定發(fā)酵液OD值可以確定酵母菌的濃度。本實驗使用722可見光分光光度儀，600nm波長測定其吸光度。取150μL發(fā)酵液稀釋20倍至3mL，以液體培養(yǎng)基為空白對照進(jìn)行比色測定，OD600=讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

2 實驗結(jié)果

2.1 氯化鈣、硫酸銨、磷酸二氫鈉對酵母菌株發(fā)酵的影響

在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加氯化鈣、硫酸銨、磷酸二氫鈉，使各營養(yǎng)鹽終濃度達(dá)到0.025%、0.05%、0.1%、0.2%。接種后于30℃ 180rpm培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液中乙醇含量，分別計算其乙醇轉(zhuǎn)化率(YE/S)，結(jié)果見表1。

由表中可見，在發(fā)酵培養(yǎng)基中額外添加適量營養(yǎng)鹽類可不同程度提高酵母菌株YPH499-CZ發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的效率。其中添加氯化鈣最適濃度為0.1%，添加硫酸銨最適濃度為0.1%，添加磷酸二氫鈉最適濃度為0.025%。

2.2 肌醇對重組酵母菌株發(fā)酵的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中額外添加肌醇使終濃度分別達(dá)到0.01%、0.05%、0.1%和0.2%(M/V)，在30℃ 180rpm培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液中乙醇含量，計算發(fā)酵木糖的乙醇轉(zhuǎn)化率(YE/S)，計算方法同前。肌醇對重組酵母菌株發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇有明顯促進(jìn)作用，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加肌醇0.1%時乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高。見圖1。

2.3 植酸鈉對重組酵母菌株發(fā)酵的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中額外添加植酸鈉使終濃度分別達(dá)到0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%，在30℃ 180rpm發(fā)酵培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液中乙醇含量，計算乙醇轉(zhuǎn)化率(YE/S)，計算方法同前。植酸鈉能夠顯著促進(jìn)重組酵母菌株發(fā)酵乙醇的能力，在添加植酸鈉達(dá)到0.1%時，發(fā)酵產(chǎn)生乙醇含量達(dá)到最高，但是繼續(xù)增加植酸鈉對發(fā)酵有抑制作用。見圖2。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值對重組酵母菌株發(fā)酵的影響

調(diào)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值分別為1.5、3.5、5.5、7.5和9.5，接種后于30℃ 180rpm發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵過程中不同時間點取樣，測定發(fā)酵液OD600值，繪制其生長曲線。發(fā)酵結(jié)束測定發(fā)酵液中乙醇含量，計算乙醇轉(zhuǎn)化率(YE/S)。該重組菌株對pH值的耐受范圍比較廣泛，在pH值為1.5時不生長，起始pH值為5.5時其生長狀態(tài)最佳(見圖3)。在發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值為5.5時，其乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高(見圖4)。

2.5 培養(yǎng)溫度對重組酵母菌株發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基接種后分別置于22℃、30℃、37℃恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵過程中定時取樣，測定菌生長密度，繪制其生長曲線。在發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中乙醇含量，計算乙醇轉(zhuǎn)化率(YE/S)。結(jié)果顯示重組酵母菌株YPH499-CZ在30℃生長達(dá)到最佳，并且相應(yīng)乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高(見圖5、6)。

3 討論

重組酵母菌株YPH499-CZ能夠高效利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，具有潛在應(yīng)用價值與社會效益，鑒于其基因型的改變，其生長特點和發(fā)酵培養(yǎng)條件都可能發(fā)生一定的改變，為了優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)條件，我們在已有研究基礎(chǔ)上考察了多種營養(yǎng)元素以及溫度、pH值對其生長和發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯化鈣、硫酸銨均能不同程度提高發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效率，添加磷酸二氫鈉效果不顯著，并且加入高濃度磷酸二氫鈉對發(fā)酵產(chǎn)乙醇效率有一定抑制作用。趙寶華等[3]研究顯示外加鈣離子對釀酒酵母產(chǎn)酒精能力和耐受酒精能力有顯著促進(jìn)作用;張書祥等[4]人的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母添加氯化鈣濃度為0.075%時，30℃發(fā)酵72h，酒精度最高;硫酸銨中的S元素能夠被釀酒酵母利用并且銨根離子也能夠做為氮源被利用[5]，本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相符。無機磷是細(xì)胞的重要組成成分，在酵母生理活動中具有非常重要的作用，本研究外加磷酸二氫鈉未能促進(jìn)重組酵母菌株的乙醇發(fā)酵效率，結(jié)果有待于進(jìn)一步研究。

已有研究表明，釀酒酵母的耐受酒精能力與其胞內(nèi)磷脂肌醇的含量有一定相關(guān)性[6]，因此本研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了磷脂肌醇的前體肌醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌醇對重組酵母菌株發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇有明顯促進(jìn)作用。研究已經(jīng)證實植酸鹽對某些微生物的代謝作用具有促進(jìn)作用，可以促進(jìn)特定酶和代謝產(chǎn)物的合成;李林等[7]研究發(fā)現(xiàn)植酸鈉對釀酒酵母乙醇發(fā)酵具有促進(jìn)效應(yīng);本研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加植酸鈉達(dá)到0.1%時，發(fā)酵產(chǎn)生乙醇含量明顯升高，達(dá)到1%以上則會抑制乙醇的產(chǎn)生。對重組酵母菌株發(fā)酵的溫度以及發(fā)酵起始pH的研究表明重組菌株對pH的耐受范圍廣泛，在溫度30℃培養(yǎng)基起始pH值為5.5時其生長狀態(tài)最佳，并且乙醇含量達(dá)到最高，與進(jìn)行基因改造前的親本釀酒酵母菌株生長條件相比沒有改變。本研究對能夠發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇的重組酵母菌株YPH499-CZ發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步研究，為其推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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[3] 趙寶華，張莉. 外加肌醇和鈣離子對釀酒酵母乙醇發(fā)酵的影響[J]. 微生物學(xué)報，1999，39(2):174-177.

[4] 張書祥，肖亞中，任杰，等. 添加營養(yǎng)鹽對酒精酵母發(fā)酵的影響[J]. 生物學(xué)雜志，1997，14(1):23-25.

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[7] 李林，傅庭治，曹幼琴. 植酸鈉對釀酒酵母乙醇發(fā)酵的促進(jìn)效應(yīng)[J]. 微生物學(xué)雜志，1994，14(1):15-19.

(收稿日期:2010-03-31)