晚期糖基化終末產物受體在2型糖尿病大鼠種植體骨結合中的表達

[摘要] 目的 探討晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)及其受體影響種植體骨結合的可能機制。方法 建立2型糖尿病大鼠模型，隨機分為正常對照組、糖尿病對照組、正常種植組、糖尿病種植組，分別于正常種植組和糖尿病種植組脛骨近骺端植入純鈦種植體，于植入8周后下腔靜脈采血處死大鼠，用Hitachi2850型熒光分光光度計測定血清中AGEs含量的變化，取種植側脛骨拍X線片和骨密度測量，并制作病理標本，采用免疫組化檢測種植體周圍晚期糖基化終末產物受體(RAGE)的表達并作圖像分析。結果 4周后，糖尿病種植組和糖尿病對照組與正常對照組和正常種植組比較，骨質疏松明顯，脛骨BMD明顯下降，血清中AGEs含量增多;糖尿病對照組和正常對照組骨組織RAGE蛋白的陽性表達強度分別低于前兩組。圖像分析陽性細胞率和陽性細胞平均光密度值結果，糖尿病種植組明顯高于正常種植組，糖尿病對照組明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05);糖尿病種植組高于糖尿病組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 AGEs-RAGE途徑是2型DM影響種植體骨結合的機制之一。

[關鍵詞] 種植體骨結合; 骨密度; 晚期糖基化終末產物; 晚期糖基化終末產物受體

[中圖分類號] R782.12 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)15-09-03

The Expression of Advanced Glycation End Product Receptor in Implant Osseointegration of Type 2 Diabetic Rats

MENG Bing JIAO Yanjun LI Lin SUN Xiaojun

Department of Stomatology，the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] ObjectiveTo explore the mechanism possible that advanced glycation end products(AGEs)and their receptors affect the implant osseous integration. MethodsEstablish a rat model of type 2 diabetes，then divided them into normal control group，diabetic control group，normal planting group，diabetes planting groups randomly，the diabetic planting group and the normal planting group were implanted the titanium implant near the epiphyseal end of tibia. 8 weeks later，collect the inferior vena cava blood，test the serum AGEs levels in the changes by fluorescence spectrophotometer Hitachi2850，shoot lateral tibial X-ray films，the the bone mineral measurements density，and make the production of pathological specimens，detect the expression of RAGE using immunohistochmecal method. Results8 weeks later，diabetes planting group and the diabetic control group expressed significant osteop-orosis，tibial BMD decreased and serum levels of AGEs increased，the expression of RAGE protein in bone tissue was stronger than the other two groups. Thers is statistically significant difference between each two groups(P<0.05). ConclusionAGEs-RAGE is one of mechanism of type 2 dcabetes to influence the implant osseous integration.

[Key words]Osseointegration; BMD; AGEs; RAGE

骨整合是口腔種植的生物學基礎。研究發現糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者口腔種植成功率較正常人群低，且更容易發生周圍牙槽骨的吸收[1];動物實驗結果顯示DM動物植入種植體后，種植體和骨組織的結合水平顯著下降[2]。但DM影響種植骨整合的具體機制還不清楚，其因素多而復雜。本研究在建立大鼠2型DM模型的基礎上，比較正常大鼠與DM大鼠脛骨種植后周圍骨組織中RAGE的表達變化。

1 資料和方法

1.1 一般資料

1.1.1 藥物 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ;美國Sigma公司)，檸檬酸溶液，純鈦種植體(1.3mm×7mm，江蘇中邦)。

1.1.2 動物 2月齡SD雄性健康大鼠45只，體重170～230g，由山西省中醫研究所提供。

1.1.3 主要儀器 one Touchп快速血糖儀(美國強生公司)，Lunar Prodigy雙能X線骨密度儀(美國Lunar公司)，LEICA RM2235切片機(德國Leica公司)，熒光分光光度計(Hitachi 2850型)，抗RAGE多克隆抗體(武漢博士德公司);Axioskop2 plus顯微鏡及圖像分析系統(德國ZEISS公司)。

1.2 方法

1.2.1 2型DM模型制備 所有大鼠適應性喂養1周后，禁食12h，隨機分為DM模型組和正常組。DM模型組高糖高脂飲食四周后，腹腔內一次性注射枸櫞酸鈉鏈脲佐菌素溶液30mg/kg。標準飲食連續喂養2周，血糖值>16.7mmol/L視為建模成功[3]，否則予以剔除。正常組則注射等量枸櫞酸鈉溶液。22只大鼠血糖達到標準，剩余3只未達到上述標準被淘汰。飼養過程中模型組大鼠死亡2只。將20只建模成功的大鼠分為DM組對照組和DM種植組，每組10只。將20只正常組大鼠分為正常對照組和正常種植組，每組10只。

1.2.2 種植體植入 4%戊巴比妥鈉(1mL/kg)腹腔注射麻醉兩組種植大鼠，顯效后將大鼠仰臥固定于手術臺上，兩側下肢備皮消毒，切開皮膚、皮下組織，在右側脛骨近骺端用直徑1.3mm齒科鉆在生理鹽水冷卻下形成種植體窩，然后將純鈦種植體植入。術區給予青霉素粉劑，對位縫合傷口。對照組行假手術。術后基礎飼料喂養。

1.2.3 樣品采集 8周后禁食12h后，測血糖、體重，下腔靜脈采血處死大鼠。取下種植體，剔除包括骨膜在內的所有軟組織，每組取大鼠的右側脛骨行骨密度測量和X線拍片，10%中性緩沖福爾馬林液固定，EDTA脫鈣，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，取種植體周圍5mm的骨組織進行5μm切片。用Hitachi2850型熒光分光光度計測定血清中AGE的含量。

1.2.4 骨密度測定 剔脛骨表面的軟組織，以Lunar Prodigy雙能X線骨密度儀測定右側脛骨種植體的骨礦物密度[4]。

1.2.5 骨組織RAGE免疫組織化學染色及圖像分析 按RAGE免疫組化染色試劑盒說明書操作，常規脫水、透明、中性樹脂封片。在顯微鏡下對免疫組化結果進行觀察。用Axioskop2 plus圖像分析系統對RAGE陽性細胞率和陽性細胞平均光密度值作定量分析。

1.3 統計學處理

統計軟件SPSS13.0行數據分析，結果以(χ±s)表示。采用方差分析，組間比較用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 種植體愈合情況

20只種植大鼠均健康存活，創口愈合良好。種植體均未出現松動、兩例DM種植組大鼠種植區皮下組織出現膿液。其余未見紅腫破潰。

2.2 胰島素對DM大鼠種植體BMD、血清中AGE、血糖和體重的影響

DM組和正常對照組及DM種植組和正常種植組骨BMD、血清中AGE、血糖及體重變化的比較均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 X線片觀察的結果

DM種植組種植體周圍脛骨骨皮質較正常種植組薄，部分出現吸收、骨髓腔變寬、松質骨骨紋理稀疏變細(封三圖1)。正常種植組種植體周圍脛骨皮質骨密度較均勻，骨髓腔較DM組窄，松質骨骨紋理致密而粗細均勻(封三圖2)。DM種植組種植體周圍骨組織表現為較低密度的影像。

2.4 免疫組化檢測及圖像分析結果

(1)四組大鼠脛骨周圍骨組織均檢測到RAGE的陽性表達。糖尿病種植組大鼠種植體周圍骨組織RAGE蛋白表達強烈且廣泛，染色深，有的甚至成片狀(封三圖3)。正常種植組亦出現RAGE蛋白的陽性表達，但均散在且淡染(封三圖4)。糖尿病對照組和正常對照組骨組織RAGE蛋白的陽性表達強度分別低于前兩組(封三圖5、圖6)。

(2)PBS組作為一抗陰性對照組，四組大鼠骨組織均未檢測到RAGE的表達。

(3)圖像分析RAGE陽性細胞率和陽性細胞平均光密度值結果示:糖尿病種植組明顯高于正常種植組，差異有統計學意義(P<0.05);糖尿病對照組也明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05);糖尿病種植組高于糖尿病對照組，差異有統計學意義(P<0.05);正常種植組和正常對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、3。

3 討論

牙種植修復已經成為一種重要的缺牙修復方式。然而DM患者的種植修復失敗率往往較高，初期骨結合較差。文獻表明，2型DM會影響大鼠皮質骨區的骨再生(折裂修復時產生的)，這種再生是由骨外膜干細胞通過膜內和軟骨內的骨分化而形成新骨[5]。而2型DM會干擾骨重建的整個過程，使骨折愈合延遲，骨組織的生物機械學強度下降[6]。另外，DM還使成骨能力發生缺陷，包括骨礦化和基質形成的減少或延遲[7]。

糖尿病患者持續的高血糖，可與機體多種蛋白成分發生糖基化反應，最終生成AGEs，是糖尿病病理變化的一個特征。目前已經確認的與AGEs結合的受體包括糖基化終末產物受體(RAGE)、Ⅰ型和Ⅱ型清道夫受體、寡糖轉移酶48、80K2H磷酸蛋白和半乳糖結合蛋白[8，9]，RAGE是與AGEs結合的主要受體。有研究表明在糖尿病動物的顱蓋骨組織間充質細胞、成骨細胞中，RAGE的表達上調，應用RAGE的配體可以導致骨形成抑制，并隨著劑量的增加，抑制作用增強[10，11]，從而影響骨重建。

本研究結果表明，2型DM大鼠血清中AGEs含量明顯升高，種植體周圍骨密度影像則明顯低于正常種植組，脛骨骨皮質菲薄，部分吸收，骨髓腔增寬，松質骨骨紋理稀疏、變細。2型DM大鼠種植體周圍骨組織RAGE蛋白表達較對照組強烈且廣泛，染色深甚至成片狀，明顯高于對照組。圖像分析陽性細胞率和陽性細胞平均光密度值也明顯高于對照組。因此有理由認為，AGEs-RAGE途徑是2型DM影響種植體骨結合的機制之一。

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(收稿日期:2010-03-16)