基于Aunano-PB\\AEAPS-Dextran-Fe3O4和Aunano修飾的前列腺特異性抗原電流型免疫傳感器的研究

[摘要] 目的 采用普魯士蘭-納米金(Aunano-PB)、氨基硅烷化-葡聚糖-四氧化三鐵納米復(fù)合物(AEAPS-Dextran-Fe3O4)及納米金(Aunano)共修飾于氧化銦錫(ITO)電極表面固載抗體制得高靈敏前列腺特異性抗原電流型免疫傳感器。方法 先將ITO電極表面滴加適量Aunano-PB，隨后將AEAPS-Dextran-Fe3O4滴涂在ITO玻璃電極的Aunano-PB膜上，然后通過(guò)靜電吸附Aunano并固定前列腺特異性抗體(anti-PSA)，制得電流型免疫傳感器。結(jié)果 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器響應(yīng)的峰電流值與前列腺特異性抗原(PSA)濃度在該傳感器(0.8～20)ng/mL及(20～170)ng/mL 的范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系，檢測(cè)下限為 0.6ng/mL。結(jié)論 成功建立了前列腺特異性抗原免疫傳感器，該方法制備簡(jiǎn)單，操作便捷，檢測(cè)下限低。

[關(guān)鍵詞] 免疫傳感器; 前列腺特異性抗原; 氨基硅烷化-葡聚糖-四氧化三鐵納米復(fù)合物; 普魯士蘭-納米金; 納米金

[中圖分類號(hào)] R737.25;R730.45 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2010)13-81-03

An Immunosensor for Prostate Specific Antigen Based on Aunano-PB，AEAPS-Dextran- Fe3O4 and Aunano

CHENG Ping LI Yan ZHENG Junsong HE Juan FANG Lichao HUANG Hui DENG Jun JIANG Lili

Department of Clinical Laboratory，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China

[Abstract] ObjectiveTo design a sensitive amperometric immunosensor for the detection of prostate specific antigen(PSA) based on Aunano-PB nanocomposites，AEAPS-Dextran-Fe3O4 nanocomposites and Aunano modified indium tin oxides(ITO) electrode. MethodsFirst the ITO electrode was modified with Aunano-PB nanocomposites. Then AEAPS-Dextran-Fe3O4 nanocomposite was dropped on the Aunano-PB modified-ITO electrode surface. Finally，Aunano was adsorbed onto the composite surface for immobilizing PSA antibodies. ResultsThe optimal Ph value was 7.0，and incubation time was 10 min. In the optimal conditions，the amperometric immunosensor showed a linear increase in the relative intensity at two PSA concentrations of 0.8 to 20ng/mL and 20 to 170ng/mL with a detection limit of 0.6ng/mL. ConclusionThe amperometric immunosensor established in this study has been demonstrated to besimple and convenient in the detection of PSA，with low detection limit.

[Key words]Immunosensor; Prostate specific antigen; AEAPS-Dextran-Fe3O4 nanocomposite; Aunano-PB; Aunano

人前列腺特異性抗原(PSA)是一個(gè)32-33 KDa的單鏈糖蛋白，也是重要的前列腺腫瘤標(biāo)志物。檢測(cè)PSA方法較多，以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和放射免疫分析法(RIA)最為常用。但RIA具有放射性危害，標(biāo)記物放射性半衰期較短，操作過(guò)程繁瑣，且需要昂貴的射線檢測(cè)儀;ELISA操作步驟也顯冗長(zhǎng)，還需用酶標(biāo)儀。為克服上述方法的不足，國(guó)外在幾年前研制出檢測(cè)PSA的免疫層析試條。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道了多種電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于檢測(cè)血清PSA濃度，其中電流型傳感器大多是用過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶標(biāo)記的方法。

本研究擬建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、低廉的血清PSA濃度的檢測(cè)方法，通過(guò)制備Aunano-PB、AEAPS-Dextran- Fe3O4納米復(fù)合物及Aunano納米顆粒協(xié)同修飾ITO電極表面固定PSA抗體，制得的電流型免疫傳感器具有靈敏度高、檢測(cè)下限低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

前列腺特異性抗原(PSA)抗體(anti-PSA)(3.2mg/mL)購(gòu)自天津天健生物制藥有限公司，前列腺特異性抗原(PSA)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司，ITO玻璃購(gòu)自深圳元亨光電有限公司，葡聚糖T-10(相對(duì)分子質(zhì)量10 000)購(gòu)自BBI 公司，檸檬酸三鈉、AEAPS購(gòu)自Alfa Aesar公司，小牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，氯金酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鐵氰化鉀、氯化亞鐵等其它試劑均為分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

MEC-12B多功能微機(jī)電化學(xué)分析儀為江蘇江分電分析儀器有限公司產(chǎn)品，TU-1901紫外分光光度計(jì)為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品，TECNAI10透射電子顯微鏡為荷蘭飛利浦產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ITO的預(yù)處理 將ITO玻璃切割成5mm×25mm的玻片[1]，依次用丙酮、二氯甲烷超聲清洗10min，蒸餾水超聲清洗3次，每次2min。再將其置于H2O:H2O2(30%):NH3(25%)(5:1:1)混合液中，37℃ 攪拌1h，用蒸餾水沖洗后放100℃ 烘箱烘干。最后用白色膠布分割一工作窗區(qū)域(5mm×5mm)，用記號(hào)筆做好標(biāo)記。1.2.2 納米金的制備 用檸檬酸鈉還原氯金酸方法制得平均粒徑為16nm 的納米金(Aunano)溶膠。取100mL 氯金酸(0.01wt%)在沸騰后，邊攪拌邊迅速加入5mL 檸檬酸鈉(1wt%)，保持沸騰10min 后室溫自然冷卻，然后用0.45μm 孔徑的纖維素薄膜過(guò)濾，4℃ 冰箱放置備用。

1.2.3 Aunano-PB納米復(fù)合物制備 將含有1.0mM FeCl3·6H2O、1.0 mM K3Fe(CN)6、0.1 M KCl 和0.025 M HCl 的混合水溶液迅速加入到10 mL的上述制備的Aunano溶液中，室溫強(qiáng)力攪拌24h(避免陽(yáng)光直射)，形成褐色復(fù)合物。Aunano-PB納米復(fù)合物用丙酮離心洗滌兩次，最終得到濃縮納米復(fù)合物。

1.2.4 AEAPS-Dextran- Fe3O4磁性納米顆粒的制備葡聚糖包被Fe3O4的制備[2] 通過(guò)共沉淀法制備外包葡聚糖的四氧化三鐵納米顆粒(Dextran-Fe3O4)。具體步驟:稱取FeCl3·6H2O 9.36g、FeCl2·4H2O 3.44g、葡聚糖T-10 10g，在通氮條件下溶于120mL三蒸水中，在60℃條件下1000r/min機(jī)械攪拌，恒流泵以1mL/min滴加28%氨水120mL，反應(yīng)1h后得到黑色膠狀物。自然冷卻至室溫，10000r/min離心10min，棄去沉淀，收集上清液。將上清液用冰乙酸調(diào)pH值至8.0，0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝后置于4℃?zhèn)溆谩Ｅ渲艫EAPS溶液，取3.5mM AEAPS加入10mL甲苯/甲醇(甲苯∶甲醇=1∶1)溶液。向50mL Dextran-Fe3O4溶液中加入5mL AEAPS溶液，在60℃通氮條件下，1000r/min機(jī)械攪拌反應(yīng)4h，得到AEAPS-Dextran-Fe3O4溶液，分裝后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 傳感器的制備 按照He等[3]報(bào)道做少量修飾，將超聲分散后的10μL Aunano-PB納米復(fù)合物滴涂到干凈的ITO玻璃電極上，室溫下自然晾干。再將15μL 黑色AEAPS-Dextran- Fe3O4懸液滴加修飾后電極表面，待干燥后浸泡在納米金溶液中約6h，取出沖洗，再置于PSA抗體中4℃ 孵育過(guò)夜(約12h)。最后電極在0.25%小牛血清白蛋白(BSA)溶液中孵育1h，封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 電極修飾過(guò)程的電化學(xué)表征

測(cè)定電極制備過(guò)程的循環(huán)伏安特征(圖1)。圖1中曲線a為裸ITO電極的CV圖;當(dāng)Aunano-PB納米復(fù)合物修飾電極后，圖中在E=0 V附近出現(xiàn)一對(duì)普魯士蘭特征氧化-還原峰(曲線b);將AEAPS-Dextran- Fe3O4磁性納米復(fù)合物固定到電極表面后，進(jìn)一步提高了電子傳遞速率，使其峰電流顯著增大(曲線c)。當(dāng)Aunano固定到AEAPS-Dextran-Fe3O4磁性納米復(fù)合物修飾的電極表面時(shí)，峰電流明顯降低(曲線d)。當(dāng)anti-PSA吸附在Aunano表面時(shí)，峰電流降低(曲線e)，這是由于anti-PSA是非導(dǎo)電物質(zhì)，阻礙了電子的傳遞。用BSA封閉電極非特異結(jié)合位點(diǎn)后，峰電流進(jìn)一步降低(曲線f);曲線g是前列腺特異性抗原為1ng/mL由于抗原抗體結(jié)合形成的復(fù)合物阻礙電子的傳遞，與f比較g的氧化還原峰明顯降低。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

pH值的優(yōu)化:當(dāng) pH<7.0 時(shí)，峰電流隨pH值的增大而增大;當(dāng)pH=7.0時(shí)，峰電流值達(dá)到最大;pH>7.0 時(shí)，峰電流隨pH值的增大而減小。因此，本實(shí)驗(yàn)選定的PBS測(cè)試溶液的pH值為7.0。孵育時(shí)間的優(yōu)化:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)10min時(shí)，抗原-抗體反應(yīng)已基本達(dá)平衡，故實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇10min 為抗原和抗體的反應(yīng)時(shí)間。

2.3 免疫傳感器的響應(yīng)特性

從圖2中可以看出，PSA的濃度在(0.8～20)ng/mL及(20～170)ng/mL 的范圍內(nèi)與單位面積峰電流保持良好的線性關(guān)系。兩線性方程分別為:y=0.322x-12.684，相關(guān)系數(shù)分別為0.9907;y=0.016x-6.599，相關(guān)系數(shù)分別為0.9906，檢測(cè)下限為 0.6ng/mL。

將制備好的3支平行電極置于4℃ 下放置，在四周內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定其響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為9.98%、7.21%、8.20%，平均為8.46%，說(shuō)明該傳感器有較好的穩(wěn)定性。將4支平行電極放入30ng/mL AFP 溶液中孵育，在相同條件下重復(fù)測(cè)定峰電流值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.34%，說(shuō)明傳感器重現(xiàn)性良好。

3 討論

近年來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道了多種電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于檢測(cè)血清PSA濃度，其中的電流型傳感器大多是用過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶標(biāo)記的方法。最近磁性納米顆粒Fe3O4用于傳感器的研究引起了人們極大興趣。Ajeet Kaushik等利用殼聚糖作為穩(wěn)定劑包被磁性納米顆粒Fe3O4，Ying Zhuo制備了以Fe3O4顆粒為核，依次在核外包裹納米普魯士蘭和納米金顆粒的具有三層核殼結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合物。這些納米復(fù)合物使其增加許多特殊性能:一方面可以減慢顆粒的聚沉，使顆粒長(zhǎng)時(shí)間保持均一性;另一方面能顯著提高顆粒的生物相容性和成膜性等。

另外納米金顆粒與普魯士蘭納米顆粒結(jié)合制備Aunano-PB納米復(fù)合物基于其在電化學(xué)方面優(yōu)越的性能。

本文采用AEAPS-Dextran-Fe3O4磁性納米復(fù)合物、Aunano-PB納米復(fù)合物和Aunano為固定介質(zhì)及響應(yīng)增強(qiáng)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了無(wú)標(biāo)記測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明此傳感器制作過(guò)程簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，檢測(cè)范圍為(0.8～20)ng/mL及(20～170)ng/mL，檢測(cè)下限為0.6ng/mL。有較低的檢測(cè)限、較快的檢測(cè)速度及適宜的線性范圍。本實(shí)驗(yàn)研究了該方法對(duì)PSA的檢測(cè)，同時(shí)也可用于其他免疫物的檢測(cè)，在臨床診斷中有重要作用。

[參考文獻(xiàn)]

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(收稿日期:2010-03-18)