頭孢卡品酯膠囊微生物限度檢查方法驗證試驗研究

[摘要] 按照《中國藥典》2005年版二部微生物限度檢查方法進行驗證試驗，建立頭孢卡品酯膠囊微生物限度檢查方法。該藥的細菌計數方法為薄膜過濾法;霉菌及酵母菌計數方法為平皿法;控制菌(大腸埃希菌)計數方法為薄膜過濾法和培養基稀釋法。

[關鍵詞] 頭孢卡品酯膠囊; 薄膜過濾法; 平皿法; 培養基稀釋法

[中圖分類號] R978.1+1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)13-86-02

頭孢卡品酯膠囊是由頭孢卡品酯和輔料組成的膠囊劑，為第四代口服頭孢類抗生素。具有廣譜抗菌活性，對耐青霉素(含中等程度耐藥)的肺炎鏈球菌的活性很強，對很多耐抗生素的病原菌均有良好療效。

由于該藥具有很強的抗菌作用，需要通過驗證來建立它的微生物限度檢查方法。

本試驗用2005年版中國藥典規定的3株細菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)、2株真菌(黑曲霉、白色念珠菌)[1]對三批頭孢卡品酯膠囊進行了微生物限度檢查法的驗證試驗，以確認所采用的方法是否適合于該藥品的細菌、霉菌、酵母菌數的測定和控制菌檢查及檢查藥品本身污染微生物的狀況，結果報道如下。

1 實驗材料

1.1 儀器

HTY-2000A型集菌儀、泵管FPY330型(批號20080622)、HTY-K型培養器專用震蕩儀、HTY反復使用集菌培養器(杭州泰林生物技術設備有限公司);LRH-250生化培養箱(上海索普儀器有限公司)。

1.2 試藥

營養瓊脂培養基(批號071129)、營養肉湯培養基(批號071119)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號071217)、BL培養基(批號071210)、MUG培養基(批號080716)北京三藥科技開發公司;靛基質試驗歐-波試液(批號080730)江蘇宜興永信生物有限公司;0.9%無菌氯化鈉溶液、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(揚子江藥業集團有限公司輸液車間配制)。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC(B)44102];金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003];枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501];黑曲霉[CMCC(F)98003];白色念珠菌[CMCC(F)98001]均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法

2.1 菌液制備[2]

分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中在30～35℃中培養18～24h;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中在23～28℃中培養24～48h，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成含菌數為(50～100)cfu/mL的菌懸液;另外接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中，在23～28℃中培養5d，加入5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成含孢子數為(50～100)cfu/mL的菌懸液，備用。

2.2 供試液制備

供試液:取供試品5g，加入已滅菌的吐溫80約5mL，慢慢加入45℃的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，邊加邊攪拌，保溫振搖使混勻，靜置后的上清液作為1∶20的供試液。

稀釋劑對照液:分別取滅菌的吐溫80約5mL，分別加入約5000～10000CFU的菌懸液，慢慢加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，邊加邊攪拌，使混勻，作為含菌量(50～100)cfu/mL的稀釋劑對照液。

各試驗菌分別制備一份。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌常規法計數方法

2.3.1 試驗組 取 1∶20 的供試液2mL，每1毫升供試液和(50～100)cfu/mL試驗菌同時加入平皿中，立即傾注相應規定的培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定菌落數。

2.3.2 菌液組 分別取各備用試驗菌，加入與試驗組等量菌液，測定每一菌株所加的試驗菌數。

2.3.3 供試品對照組 方法同試驗組，不加試驗菌，測定供試品的本底菌數。

2.3.4 稀釋劑對照組 取稀釋劑對照液代替供試品，按試驗組的方法操作，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。

2.3.5 菌回收率計算 試驗組回收率=(試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數)/(菌液組的平均菌落數)×100%;稀釋劑對照組回收率=(稀釋劑對照組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數)/(菌液組的平均菌落數)×100%。

2.4 細菌薄膜過濾法計數方法

2.4.1 試驗組 取供試液1mL，至含有pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液約100mL的濾筒內，振搖過濾，用45℃ pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液振蕩沖洗，每次50mL，沖洗量分別為300mL、400mL、500mL，在最后一次沖洗液中加入(50～100)cfu/mL的菌懸液。過濾后取出濾膜，菌面朝上，貼于營養瓊脂培養基上，于30～35℃倒置培養，以48小時點計菌落數，各制備一個平皿。

2.4.2 菌液組 分別取各備用試驗菌各1mL，注入平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基約15～20mL，混勻凝固，于30～35℃倒置培養，以48小時點計菌落數。各平行制備2個平皿。

2.4.3 供試品對照組 方法同2.4.1，不加菌懸液。

2.4.4 稀釋劑對照組 取稀釋劑對照液代替供試液，操作方法同2.4.1。

2.5 控制菌檢查方法

2.5.1 常規法

2.5.1.1 試驗組 取供試液20mL，大腸埃希菌菌懸液1mL，置250mL錐形瓶中，加入約100mL的膽鹽乳糖增菌培養基，于35～37℃培養18～24h。

2.5.1.2 陰性菌對照組 方法同試驗組，用金黃色葡萄球菌代替大腸埃希菌，依法測定。

2.5.2 薄膜過濾法

2.5.2.1 試驗組 取供試液20mL，至250mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，振搖過濾，然后用45℃ pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液振蕩沖洗，每次50mL，沖洗量為300mL，在最后一次沖洗液中加入(50～100)cfu/mL的大腸埃希菌菌懸液1mL，過濾后取出濾膜，置250mL錐形瓶中，加入約100mL的膽鹽乳糖增菌培養基，于35～37℃培養18～24h。

2.5.2.2 陰性菌對照組 方法同試驗組，用金黃色葡萄球菌代替大腸埃希菌，依法測定。

2.5.3 薄膜過濾和培養基稀釋法

2.5.3.1 試驗組 取供試液20mL，至250mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，振搖過濾，然后用45℃ pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液振蕩沖洗，每次50mL，沖洗量為300mL，在最后一次沖洗液中加入(50～100)cfu/mL的大腸埃希菌菌懸液1mL，過濾后取出濾膜，置250mL錐形瓶中，加入約200mL的膽鹽乳糖增菌培養基，于35～37℃培養18～24h。

2.5.3.2 陰性菌對照組 方法同試驗組，用金黃色葡萄球菌代替大腸埃希菌，依法測定。

3 結果

3.1 細菌、霉菌及酵母菌常規法計數方法的驗證

見表1。

從表1結果可以看出，霉菌及酵母菌的回收率>70%，可采用平皿法;三株細菌的回收率均<70%，稀釋劑對照組的菌回收率均>70%，由此說明該供試品有很強的抑制細菌的作用，應重新選擇細菌計數方法的驗證。

3.2 細菌薄膜過濾法計數方法的驗證

見表2。

從表2可以看出，采用薄膜過濾法檢驗頭孢卡品酯膠囊，沖洗量300mL/膜，稀釋劑對照組、試驗組的菌回收率均高于70%，符合驗證要求，說明經薄膜過濾后可以消除頭孢卡品酯膠囊的抑制細菌的活性，因此頭孢卡品酯膠囊的細菌數測定可采用薄膜過濾法測定。

3.3 控制菌檢查方法驗證結果

見表3。

從表3可以看出，控制菌(大腸埃希菌)采用薄膜過濾法和培養基稀釋法檢查結果符合規定。

4 結論

通過對本品進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證，可以確認采用平皿法適用于頭孢卡品酯膠囊的霉菌及酵母菌的測定;采用薄膜過濾法適用于頭孢卡品酯膠囊的細菌的測定。

通過對本品控制菌檢查方法的驗證認為，頭孢卡品酯膠囊的大腸埃希菌檢查采用薄膜過濾和培養基稀釋法檢查。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會編. 中華人民共和國藥典(二部)[M]. 北京:化學工業出版社，2005:附錄6.

[2] 中國生物制品檢定所編. 中國藥品檢驗標準操作規范[M]. 北京:中醫藥科技出版社，2005:335-341.

(收稿日期:2010-03-01)