一種優良半矮稈水稻品種的分離與分子鑒定

摘要: 株1S是中國南方稻區雜交水稻育種廣泛應用的優良秈型溫敏雄性核不育系. 為了改良其農藝性狀， 我們采用體細胞無性系誘變方法篩選半矮稈突變體. 本文報道了2個體細胞無性系突變體SV1S 和SV14S的表型和初步分子鑒定結果. 與親本株1S相比， 突變體的高度降低， 基部節間長度縮短， 節間壁顯著增厚， 但是上部的節間變化不明顯. 更重要的是， 我們發現赤霉素生物合成途徑中的關鍵酶基因GA20ox-2出現了約200 bp的缺失突變， 導致該基因在半矮稈突變體中的轉錄水平降低. 研究結果表明， 突變體SV1S和SV14S很可能是由于同一缺失突變導致赤霉素合成受阻， 從而部分導致了半矮稈性狀的出現. 然而， 2個突變體苗期的高度相同， 以及糊粉層細胞#61537;-淀粉酶活性和赤霉素敏感性降低等性狀與以前報道的sd-1突變體有所不同. 因此， 我們推測在SV突變體中可能還存在第二個突變位點. 該結果也進一步證實了體細胞無性系誘變在水稻育種中具有良好的應用前景。

關鍵詞:GA20ox-2; 赤霉素; 限制性片段長度多態性(RFLP); 水稻(Oryza sativa L.); 半矮稈

中圖分類號: 文獻標識碼:

Isolation and Molecular Characterization of Semi-dwarf Mutations in an Elite Rice Cultivar

LIN Jianzhong1， YANG Yuanzhu2， ZHAO Xiaoying1， TANG Dongying1， ZHOU Bo1，DU Changqing1， LIU Xuanming1*

(1. College of Biological Sciences， State Key Laboratory of Chemo-Biosensing and Chemometrics， Hunan Univ， Changsha， Hunan 410082， China; 2. Academy of Seed Industry of Hunan Yahua， Changsha， Hunan 410001， China)

Abstract: Zhu1S is an elite indica thermo-sensitive genic male-sterile breeding stock widely used in hybrid rice production in Southern China. To improve key agronomic traits of this elite cultivar， we used somatic mutagenesis method to screen for semi-dwarf mutations. Here we report phenotypic and preliminary molecular characterization of two somatic mutants named SV1S and SV14S. Comparing to the parent Zhu1S， these mutations reduced the plant statures， shortened and thickened the lower internodes significantly but the upper internodes slightly. Furthermore， we found an about 200bp deletion in the GA20ox-2 gene encoding the key GA metabolic enzyme and little transcription of this gene in both semi-dwarf mutant lines. These results indicate that SV1S and SV14S mutants are more likely impaired in gibberellin metabolism derived from the same mutation that is partially responsible for their semi-dwarf phenotype. Whereas， both mutants have similar height at the seedling stage and reduce slightly GA sensitivity of #61537;-amylase activity in aleurone cells， which is different from the sd-1 mutants reported previously. Therefore， we guess that there is a second-site mutation in the SV mutants. Our results further demonstrated the usefulness of using somatic mutagenesis in the rice breeding program.

Key words: GA20ox-2; gibberellin; restriction fragment length polymorphism (RFLP); rice (Oryza sativa L.); semi-dwarf

矮稈或半矮稈性狀是包括水稻(Oryza sativa L.)在內的禾谷類作物的重要性狀之一. 矮稈或半矮稈作物不僅提高抗倒伏能力， 而且不影響穗的育性和結實率， 從而提高了作物產量[1]. 眾所周知的導致糧食產量大幅提高的“綠色革命”就是由于培育和大規模推廣高產的半矮稈水稻品種所帶來的一場作物綠色革命.

赤霉素(gibberellin， GA)在調節植物的許多生理過程， 如種子萌發、莖的伸長、花和果實的發育等方面起著非常重要的作用[2-4]. 迄今為止， 從水稻分離的與赤霉素有關的突變體被歸為三類:細長型突變體、GA非敏感型突變體和GA敏感型突變體[5， 6]. 細長型突變體表現出一種組成型的持續激活的GA響應模式， 而矮稈突變體則出現GA生物合成途徑或信號轉導途徑的缺失. 如細長型水稻突變體slr1-1是由一個隱性單基因控制， 并導致組成型的GA敏感表型[7]. 隱性的GA非敏感型矮稈突變體d1是由于其異源三聚體G蛋白的α-亞單位突變， 導致GTP結合蛋白無法傳遞赤霉素信號， 使GA不能正常發揮作用， 從而導致極端矮稈性狀， 而且外源GA處理不能使莖伸長[8]. 同時， Ueguchi-Tanaka等[8]在水稻中鑒定了一種赤霉素不敏感的矮化突變體gid1， 而GID1過量表達則會導致對赤霉素超敏感. 這些研究結果表明， 赤霉素信號轉導途徑受阻使得赤霉素對植株生長發育的調節得不到有效執行，從而導致植株矮化.

在水稻中， 許多GA敏感型矮稈突變體及其相應基因已經被分離和鑒定. 如突變體dx和d18分別為內根-貝殼杉烯氧化酶和GA3氧化酶發生突變， 導致體內活性GA1的含量降低[9， 10]. 半矮稈突變體sd-1是由于GA20氧化酶-2基因(OsGA20ox-2)突變導致GA20氧化酶-2活性喪失， 體內活性GA1的含量降低[11-13]. 該突變性狀增加了抗倒伏能力和產量， 廣泛應用于水稻育種，被譽為“綠色革命”. 另一個GA20氧化酶基因(OsGA20ox-1)也已被分離和克隆， 發現特異性抑制該基因表達可以導致矮化[14]. 另外， 一個Ds標記的水稻敏感型矮稈突變體已被分離， 發現是由于GA合成的第二步催化過程中的內根-貝殼杉烯合成酶(KS)被破壞所致[15]. 這些結果表明， 赤霉素敏感型矮稈突變體是由于赤霉素生物合成途徑中某一關鍵酶的活性降低或喪失， 從而阻礙了赤霉素的生物合成和代謝， 導致內源GA含量顯著降低. 因此， 該突變類型亦稱GA缺陷型矮稈突變體. 該類絕大部分突變體呈現明顯的矮化， 外施GA可恢復其正常表型.

株1S是一種中國南方雜交水稻育種廣泛應用的優良兩系光溫敏雄性核不育系[16]. 它具有育性轉換臨界溫度低、高抗逆性和廣親和性等特點. 但是其株高偏高， 抗倒伏能力差， 容易導致雜交后代因倒伏而減產. 為了改良該農藝性狀， 采用無性系誘變育種方法選育了優良矮化突變株系SV1S 和SV14S[17]. 本研究中， 我們從形態、生理和分子水平對矮化突變株系SV1S和SV14S進行了研究， 以期闡明SV突變株系矮化的原因.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

株1S為湖南省株州市農科所培育的秈型光溫敏核不育水稻， SV1S和SV14S為本研究組利用體細胞無性系變異篩選的半矮稈突變體. 另外， 2個粳稻品種日本晴和黃殼糯在Southern雜交實驗中用作對照.

1.2 實驗方法

1.2.1 半矮稈突變體的分離

從株1S中分離 2-3 cm長的幼穗， 經表面消毒后接種于MS+2，4-D 2.0 mg/L培養基中誘導愈傷組織. 3周后將誘導的愈傷組織轉移至MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L繼代培養. 4周后將繼代培養后的胚性愈傷組織轉接至MS+2，4-D 4.0 mg/L培養3周左右， 然后轉移至MS+6-BA 2.0 mg/L誘導芽的分化. 分化苗再轉移至MS+NAA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L進行生根培養2周， 待根長好后煉苗1周， 最后移栽至大田中. 所有組織培養條件為16 h光照和8 h黑暗， 溫度為25±2°C. 分化苗(R0) 移栽至大田中， 抽穗期套袋自花受粉， 成熟期單株收種. 體細胞無性系突變體(SV)表型的初步鑒定按文獻[17 ]的方法在R1和R2代進行.

1.2.2 半矮稈突變體表型的鑒定

SV突變體的表型鑒定于R2代進行. 由于不育狀態的不育系水稻有旗葉鞘包穗現象， 對植株高度的測量影響很大[18， 19]. 因此， SV突變體及其親本株1S都必需經低溫處理恢復育性后方能測量株高和節間長度. SV突變體及其親本株1S于冬季種植于海南陵水育種基地， 利用低溫(20°C左右) 恢復育性， 于成熟期測量株高及各節間長度.

莖的組織解剖學觀察按照張全芳等 [20]的方法進行. 于抽穗期分別取株1S和SV14S的第IV節間進行石蠟切片， 然后于奧林巴斯光學顯微鏡下觀察并照相.

1.2.3 外源GA3對幼苗伸長的影響

將種子用0.1%的HgCl2消毒5-6 min， 蒸餾水沖洗3次后15 ℃下再浸種24 h， 放入光照培養箱中35 ℃催芽24 h. 等種子露白后再播于盛有蛭石的瓷盤中， 30 ℃培養3天后， 分別以7種不同濃度(1×10-10 mol/L， 1×10-9 mol/L， 1×10-8 mol/L， 1×10-7 mol/L， 1×10-6 mol/L， 1×10-5 mol/L， 1×10-4 mol/L)的GA3溶液每天澆苗的基部， 并以清水澆苗的基部作為對照， 直至第一葉停止生長為止， 比較播后第6天的第二葉鞘長度. 每種材料各個濃度測量40株， 去掉最高和最矮苗后， 測量38株苗的第二葉鞘長度. 另外， 測量播種后第7天的幼苗高度. 同樣是每種材料各個濃度測量40株， 去掉最高和最矮苗后， 測量38株苗的高度.

1.2.4 外源GA3對無胚半粒種子α-淀粉酶的誘導

參照Ueguchi-Tanaka等[8]的方法準備無胚半粒種子和α-淀粉酶的誘導. 首先配制0.2%淀粉-2%瓊脂培養基， 高壓蒸汽滅菌. 滅菌后， 待培養基冷卻至60℃左右， 于超凈工作臺上在部分培養基中加入GA3， 至終濃度為10-6 mol/L. 然后將含GA3和不含GA3培養基分別倒入滅菌培養皿中， 冷卻后備用. 挑選飽滿水稻種子， 去掉穎殼， 用70%的酒精滅菌1-2 min， 0.1%的HgCl2浸泡10-15 min， 再用無菌水沖洗5次， 在無菌條件下將種子切成兩段， 挑取無胚半粒段分別均勻地置入含GA3和不含GA3培養基的培養皿平板中， 每培養皿放置6粒種子. 30 ℃培養4天后， 加I-KI指示劑到培養皿中， 2-3 min后傾出I-KI指示劑， 用蒸餾水沖洗瓊脂表面， 然后觀察種子周圍出現的透明圈， 并測量透明圈的大小. 每種材料在不同培養基上共處理30粒種子， 即5個培養皿平板.

1.2.5 RFLP分析

采用CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)法[21]提取葉片基因組DNA. 參照Motoyuki等[22]的方法進行限制性片段長度多態性[Restriction fragment length polymorphism (RFLP)]分析. 基因組DNA (20 micro;g)經限制性內切酶HindIII和EcoRI酶切過夜后， 用0.8% (wt/vol)的瓊脂糖凝膠電泳分離， 再轉移至尼龍膜上. 按照Spielmeyer等[12]的方法采用正向引物(5’-GCGCCAATGGGGTAATTAAAACG-3’)和反向引物(5’-GGCATTCCATTGTTTGTGATTGG-3’)從GA20ox-2基因中擴增的634 bp片段作為雜交用的探針. 探針采用α-32P-ATP標記. 在0.25 mol/L Na2HPO4， 1.0 mmol/L EDTA 和 7% SDS溶液中于65 ℃雜交過夜. 在2×SSC， 0.1% SDS 溶液中于 65 ℃ 洗膜15 min， 共洗膜2次， 然后再于0.2×SSC， 0.1% SDS 溶液中于65 ℃洗膜15 min.

1.2.6 序列分析

已有研究表明， GA20ox-2 基因(GenBank accession no. AY114310)有3個外顯子和2個內含子， 定位于1號染色體上[11-13]. 為了得到GA20ox-2的旁鄰序列， 以GA20ox-2的序列在基因組數據庫中進行了BLAST搜索， 結果在粳稻品種日本晴基因組數據庫中搜索到人工細菌染色體(BAC)克隆AP003561 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccoreid=16191728)以及秈稻品種9311基因組數據庫中搜索到scalffold000946 (http://rise.genomics.org.cn/rice/jsp/report/scaffReport.jsp?scaffold_id=3550organism=9311)與GA20ox-2的序列相匹配. 然后以軟件Primer Premier 5.0分析GA20ox-2基因及其旁鄰序列的HindIII和EcoRI的酶切位點.

1.2.7 GA20ox-2的表達分析

采用Trizon RNA提取試劑盒(Invitrogen)從葉片中提取總RNA.首先采用半定量RT-PCR分析GA20氧化酶基因的轉錄水平. GA20ox-1 (GenBank accession no. U50333)的半定量RT-PCR引物序列為: 正向引物(F)為5’-CGTCACCTGCAACCAACAAT-3’; 反向引物(R)為5’-GATGGGTACGTGCAAACCAA-3’. GA20ox-2 (GenBank accession no. AY114310)的半定量RT-PCR引物序列為: 正向引物(F)為5’- TACTACAGGGAGTTCTTCGCGGACAGCA-3’; 反向引物(R)為5’- TGTGCAGGCAGCTCTTATACCTCCCGTT-3’. 作為內參的水稻肌動蛋白基因Actin (GenBank accession no. X16280) 的半定量RT-PCR引物序列為: 正向引物(F)為5’- CTGGGTTCGCCGGAGATGAT-3’; 反向引物(R)為5’- TGAGATCACGCCCAGCAAGG-3’.

隨后采用熒光定量PCR(QPCR) 進一步驗證GA20氧化酶基因的轉錄水平. QPCR在MX3000熒光定量PCR儀上進行， 以染料ROX作為參比熒光強度， 具體操作步驟見Costa等[23]的方法. GA20ox-2 的 QPCR引物與半定量RT-PCR一樣， 但是GA20ox-1 和Actin基因的QPCR引物作了相應改變. GA20ox-1的QPCR引物序列為: 正向引物(F)為5’-AATGAGCATGGTGGTGCAGCAGGAGCAG-3’; 反向引物 (R) 為5’- GTTAACCACCAGGAAGAAGCCGTGCCTC-3’. Actin的QPCR引物序列為: 正向引物(F)為5’-AGTCTGACCCATCCATTGTGC-3’;反向引物(R)為5’-TTGTCCACGCTAATCAAGAAAC-3’. 值得說明的是， 所有引物都設計在相應基因cDNA的3’端.

2 結果與分析

2.1矮稈突變體的分離和表型分析

株1S植株偏高， 節間較長， 其雜交后代抗倒伏性較差. 已有研究表明[24]， 在植物組織培養中， 體細胞容易產生突變， 所以采用體細胞無性系誘變方法篩選半矮稈突變體， 以期降低株1S的高度. 通過約2-3個月的愈傷組織誘導、繼代和分化， 得到了24個具有明顯不同于親本株1S的獨立分化植株(R0). 在R1代發現2個突變株系SV1S和SV14S表現出半矮稈性狀， 并且其他農藝性狀仍然比較優良. 經過R2和R3代的后續表型分析發現， 2個SV突變株系的半矮稈性狀沒有出現分離， 說明通過體細胞誘變的方法成功獲得了性狀穩定的半矮稈突變體. 除了植株高度變矮之外， SV1S和SV14S的表型與親本株1S基本沒有差異(圖1). 更重要的是， 突變體仍然保留了株1S的優良性狀， 包括光溫敏不育的生理特性(數據未列出).

圖1顯示了親本株1S和SV突變體的植株形態和高度. 從圖可知， 植株高度按株1S， SV14S和SV1S的順序從78.5 cm逐漸降低為60.3 cm. 同時分析了株1S和SV14S的各節間長度， 結果發現與親本株1S相比， SV14S的基部節間長度明顯縮短， 而上部節間幾乎沒有變化(圖2A和B). 該性狀不僅提高了抗倒伏能力， 而且有助于產量的增加. 另外， 進一步觀察了位于基部的IV節間橫切面， 發現SV14S節間直徑和節間壁厚度均顯著大于親本株1S (圖2C). 結果說明， 突變體SV14S增加了抗倒伏能力， 有助于提高產量.

2.2SV突變體對外源GA表現出正常的敏感性

赤霉素的一個重要生理功能是促進水稻苗的生長[25， 26]. 為了確定所獲得的半矮稈突變體是否與GA有關， 我們檢測了其GA敏感性特征. 在缺乏外源赤霉素時SV突變體的幼苗和親本株1S高度幾乎相同， 而施加外源GA3時SV突變體的幼苗卻比對照親本高(圖3A). 結果表明， SV1S和SV14S幼苗對外源赤霉素表現出正常的敏感性. 同時， 還研究了外源GA3對第二葉鞘長度的影響， 發現SV突變體和親本株1S的第二葉鞘均對不同濃度GA3敏感， 其伸長程度都非常相似(圖3B). 該結果進一步證明， SV突變體在葉鞘的生長方面也對GA敏感.

另外， 還研究了外源赤霉素對無胚半粒種子α-淀粉酶的誘導特性(圖3C). 研究發現， 在含GA3的淀粉平板中SV突變體和親本株1S的無胚半粒種子周圍均產生了明顯的暈圈， 說明都有α-淀粉酶誘導. 但是在不含GA3的淀粉平板中SV突變體和株1S都沒有產生暈圈. 該結果表明SV突變體和親本株1S無胚半粒種子的α-淀粉酶都能被外源GA3誘導， 進一步證明了SV突變體對外源赤霉素敏感， 其半矮稈性狀可能是由于活性GA的缺失引起的. 然而與親本株1S相比，SV突變體的暈斑數目較少， 暈斑的大小也較小， 說明在組織培養過程中SV突變體中可能還有其它與赤霉素合成無關的基因產生了突變， 從而導致在GA敏感性和植株高度方面產生了微小差異. 綜合以上生理研究結果可以得知， SV1S和SV14S矮化性狀不是由于赤霉素信號轉導途徑缺失引起的， 很可能是由于赤霉素生物合成途徑的缺失或其它突變導致的.

2.3 SV突變體的GA20ox-2基因中的一段缺失引起該基因的表達量降低

鑒于本研究中SV突變體的表型與已知sd-1突變體非常類似， 所以我們采用Spielneyer等[12]的限制性片段長度多態性(RFLP)方法首先研究了SV突變體的GA20ox-2基因. 采用PCR方法從親本株1S的GA20ox-2中克隆了一段長634 bp片段作為探針. 在RFLP雜交圖譜中， SV突變體和親本株1S間有明顯的譜帶差異(圖4A， B). 當基因組DAN以限制性內切酶HindIII酶切后， 親本株1S雜交條帶出現在約4.4 kb位置， 而SV突變體雜交條帶小約200 bp， 出現在4.2 kb位置(圖4A). 該結果表明在SV突變體GA20ox-2中存在一個約200 bp片段的缺失. 另外還發現， 2個野生型粳稻品種日本晴和黃殼糯的雜交條帶出現在4.6 kb位置， 比秈稻品種株1S雜交條帶大200 bp左右. 該結果意味著在秈稻和粳稻GA20ox-2區域間存在約200 bp的差異. 當基因組DNA以EcoRI酶切后， 在野生型對照品種株1S、日本晴和黃殼糯中均出現2條分別為2.3 kb和1.1 kb雜交條帶， 但是在SV突變體中僅出現一條約3.1 kb雜交條帶(圖4B). 這些結果表明在SV突變體GA20ox-2中存在一段約200 bp的缺失， 并導致GA20ox-2中的一個EcoRI酶切位點消失. 同時， 在基因組中也檢測到了另外一個GA20氧化酶基因. 在RFLP的雜交圖譜中， 雜交信號比較弱的條帶(8 kb， 圖4A;23 kb， 圖4B)可能就是另一個定位在3號染色體上的GA20氧化酶基因(GA20ox-1;GeneBank accession no.U50333)[14].

為了進一步驗證以上RFLP結果的可靠性， 對粳稻和秈稻GA20ox-2及其旁鄰序列的HindIII和EcoRI酶切位點進行了分析. 圖4C顯示了GA20ox-2區域EcoRI和HindIII酶切位點的限制性圖譜. 基于限制性圖譜和所用探針序列的分析， 在HindIII酶切的雜交圖譜中預計會出現有4412 bp雜交帶， 而在EcoRI酶切的雜交圖譜中會出現2條分別為2376 bp和1105 bp雜交帶. 正如上面所描述的一樣， 親本株1S的RFLP研究結果與預期結果完全一致， 而SV突變體RFLP結果與預期結果不同. 實際上， 通過來自秈稻品種9311的scalffold000946和來自粳稻品種日本晴的BAC克隆AP003561的序列分析發現， 在scalffold000946的39371位點有一個237 bp片段的缺失， 位于GA20ox-2 5’端的非編碼區. 這個在秈稻和粳稻間固有的差異導致在HindIII酶切RFLP雜交圖譜中， 株1S的雜交條帶比粳稻品種日本晴和黃殼糯小約200 bp. 所以這個秈稻和粳稻間固有的237 bp差異可以作為陽性對照， 從而推知與親本株1S相比較SV突變體GA20ox-2中存在一個約200 bp的缺失突變. 基于以上結果推知， 在2個SV突變體GA20ox-2中存在約200 bp的缺失突變， 導致GA20ox-2中4316位點的EcoRI酶切位點消失. 根據Ashikari等人[27]的報道， 已有4個sd-1等位基因被分離和鑒定出來. 一個來源于低腳烏尖和IR8的sd-1等位基因存在一個383 bp片段缺失， 導致了移碼突變而提前產生了終止密碼子. 其它3個分別來源于Jikkoku， Reimei和Calrose 76的sd-1等位基因均分別在不同位點出現了點突變， 從而造成了一個氨基酸的改變. 在本研究中， SV突變體GA20ox-2中出現了約200 bp缺失突變， 該突變不同于已報道的4個sd-1等位基因， 說明該突變基因是一個新的sd-1等位基因.

另外， 還分析了GA20氧化酶基因GA20ox-1和GA20ox-2在親本株1S和SV突變體間的表達差異(圖5). 首先通過半定量RT-PCR分析， 結果發現GA20ox-1在株1S， SV1S和SV14S中都有很高的表達量， 而在親本株1S和突變體SV1S， SV14S間卻沒有明顯差異. 相反， GA20ox-2在突變體SV1S和SV14S中表達量很低， 而在親本株1S中表達量較高. 隨后QPCR分析也得到了同樣的結果， 進一步證實了GA20ox-2在親本和突變體SV1S， SV14S間的表達差異性(圖5B， C). 綜合以上結果， 我們認為SV突變體GA20ox-2的缺失突變造成了該基因表達量的降低， 使植株體內活性赤霉素含量減少而導致矮稈性狀.

3 討論

體細胞無性系誘變經常在生產中用于改良作物品種. 本研究獲得的2個變突變體具有不同的半矮稈表型， 其中SV14S保留了親本株1S的大多數優良農藝性狀[17]， 表明SV14S是一個理想的半矮稈光溫敏不育系， 將來在水稻雜交育種中很有可能取代親本株1S， 具有很高的應用價值. 該優良突變體的成功誘變和篩選充分說明了體細胞無性系誘變具有比較溫和的突變特性， 能夠被用于改良在生產中具有很高品質和商業價值但是又具有某種不良性狀的水稻品種， 從而培育出更為優良的新品種.

迄今為止， 在水稻中已經有超過60個矮稈突變體被分離和鑒定出來， 并且把它們歸為了赤霉素缺陷型矮稈突變體、赤霉素非敏感型矮稈突變體和其他原因造成的矮稈突變體[29]. 例如， 突變體dx， d18和sd-1是赤霉素合成途徑的缺陷導致活性赤霉素GA1含量降低而造成矮稈[9， 10]. 突變體d1和gid1在赤霉素信號轉導途徑中出現缺陷而導致對赤霉素表現出不敏感而造成矮稈[8]. 突變體d61和d2已分別被確認為是在油菜素內酯(BR)信號受體和油菜素內酯生物合成途徑的基因發生突變而導致矮稈性狀[8， 27].

赤霉素GA20氧化酶是赤霉素生物合成途徑中的一個關鍵酶， 它催化一系列的氧化反應并消除C-20， 為催化GA合成途徑最后一步反應的酶GA β-羥基化酶(GA3ox)提供底物[30]. 在水稻中， 編碼GA20氧化酶的2個基因GA20ox-1和GA20ox-2已經被鑒定出來. 其中特異性抑制GA20ox-1的表達會導致植株高度的矮化[9， 14]. 更重要的是， 被譽為“綠色革命基因”的GA20ox-2功能的缺失而造成的sd-1矮稈突變體也被分離和鑒定出來[11-13]. 迄今為止， 已有4個sd-1的等位基因被分離和鑒定. 一個來源于低腳烏尖和IR8的sd-1等位基因存在一個383 bp片段的缺失， 導致了移碼突變而提前產生了終止密碼子. 其他3個分別來源于Jikkoku， Reimei和Calrose 76的sd-1等位基因均分別在不同位點出現了點突變， 從而造成了一個氨基酸的改變， 從而導致所編碼的GA20氧化酶部分功能的缺失. 在本研究中， SV突變體GA20ox-2基因中出現了約200 bp缺失突變， 該突變不同于已報道的4個sd-1等位基因， 因此說明該突變基因是一個新的sd-1等位基因.

植株高度， 特別是半矮稈性狀， 經常被認為是一個數量性狀， 受到多種遺傳因素的影響. 在研究中， 發現2個SV突變體在GA20ox-2基因中都存在約200 bp缺失， 說明2個突變體最初來源于組織培養中的同一個突變細胞. 然而， 2個突變株系在植株高度和α-淀粉酶對外源赤霉素敏感性方面又存在差異， 這意味著在愈傷組織的繼代、分化和突變株的分離篩選過程中2個突變株系間還有另外一個微效基因發生了突變.

與親本株1S相比， 盡管SV突變體在GA20ox-2基因中出現了約200 bp缺失突變， 導致該基因表達量降低， 而且在成熟期表現出明顯的半矮稈性狀. 但是， 在幼苗期當缺乏外源赤霉素時， 親本株1S和SV突變體都具有相同的植株高度， 而且SV突變體在水稻種子糊粉層α-淀粉酶的誘導實驗中還表現出了對外源赤霉素敏感性的降低. 這些生理性狀均與已報道的sd-1突變體有所不同[11-13]. 因此， 我們猜想在SV突變體中還存在另一個突變位點， 使得SV突變體與所報道的sd-1突變體有所差異. 目前， 我們從SV14S與一個高稈秈稻恢復系ZR02的雜交后代中篩選到了一個新型半矮稈光溫敏雄性不育系湘陵628S. 該品種已經通過了湖南省品種審定， 被確認為超級雜交早稻的優良母本. 與我們所預期的結果一樣， 湘陵628S株高72 cm左右， 并且發現在該突變體中因為雜交而丟失了GA20ox-2突變位點， 恢復為正常GA20ox-2， 從而使得其株高高于母本SV14S， 而矮于“祖母”株1S. 這進一步證實了可能存在的另一個突變位點造成了湘陵628S的株高與其母本SV14S和“祖母”株1S間的差異. 當前， 我們正在對湘陵628S中的突變位點進行圖譜定位和克隆， 以期進一步了解該突變株系的矮稈突變分子機制.

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