HPLC法測(cè)定漢中參葉中人參皂苷Rd的含量

【摘要】目的:建立HPLC法測(cè)定漢中參葉中人參皂苷Rd的含量。方法:篩選適當(dāng)提取方法，色譜柱:Inertsil ODS-sp(5μm，4.6mm×150mm);流動(dòng)相:乙腈-水(32:64);柱溫:30℃;流速:1.0ml/min;檢測(cè)波長:203nm;高效液相色譜儀測(cè)定峰面積。結(jié)果:人參皂苷Rd線性范圍在9～90ug，γ=0.9998，平均回收率為99.77%，RSD為1.67%。表明該法適用于漢中參葉中人參皂苷Rd的含量測(cè)定。結(jié)論:本法準(zhǔn)確、快速、簡便。

【關(guān)鍵詞】漢中參葉;人參皂苷Rd;HPLC

【中圖分類號(hào)】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)18-033-2

漢中參葉，即珠子參葉。為五加科人參屬植物珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥地上莖葉。為陜西秦巴山區(qū)民間習(xí)用藥材，具有清熱生津、潤喉利咽、安神的功效。主要用于肺熱口渴、喉干舌燥、暑熱生津、頭暈?zāi)垦！⑿臒ㄉ裆⑵５鹊闹委煛Ｃ耖g多以單葉入茶飲用，歌舞藝人常用來保護(hù)嗓音，保持體力，解暑。現(xiàn)化學(xué)研究表明，漢中參葉富含多種人參皂苷類成分，如人參皂苷Rd、Re、Rg1、Rg2和F2，珠子參苷F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5，F(xiàn)6[1-3]，此外，尚含多種氨基酸及微量元素[4];藥理研究表明，漢中參葉總皂苷可對(duì)抗二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，減少醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增加，抑制肉芽組織增生;對(duì)熱板引起的疼痛有一定的鎮(zhèn)痛效果;能延長缺氧條件下小鼠存活時(shí)間[5-6]。為此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法建立漢中參葉中人參皂苷Rd的含量，為客觀準(zhǔn)確評(píng)價(jià)漢中參葉藥材質(zhì)量，合理開發(fā)利用漢中參葉藥材資源提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器島津LC-2010AHT高效液相色譜儀;Shimadzu LCsolution工作站;SB-3200D型超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，180w，40kHz);BP-121S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2樣品與試劑漢中參葉采自陜西寧強(qiáng)，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥標(biāo)本館高級(jí)實(shí)驗(yàn)師王繼濤老師鑒定為珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥地上莖葉。人參皂苷Rd對(duì)照品(中國固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心提供);乙腈為色譜純(SK Chemicals公司)，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱:Inertsil ODS-sp(5μm，4.6mm×150mm);流動(dòng)相:乙腈:水(32:64)，檢測(cè)波長:203nm，流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:10μl;柱溫:30℃;理論板數(shù)按人參皂苷Rd峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

人參皂苷Rd對(duì)照品和供試品HPLC圖譜見圖1、圖2。

2.2對(duì)照品溶液配制精密稱取人參皂苷Rd對(duì)照品4.5mg，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解、定容，搖勻，待用。

2.3供試品溶液的配制取參葉粉末2g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50ml超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，加水分散，石油醚反復(fù)萃取，每次20ml，棄去石油醚層，再用水飽和正丁醇萃取3次(分別為20、15、15ml)，合并正丁醇層，水浴蒸干，殘?jiān)蒙倭考状既芙狻⒉⑥D(zhuǎn)移定容至5ml量瓶中，備用。

2.4線性關(guān)系考察分別精密吸取人參皂苷Rd對(duì)照品溶液2、5、10、15、20ul注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以人參皂苷Rd進(jìn)樣量(ug)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=126191X-39983，r=0.9998。結(jié)果表明，人參皂苷Rd在9～90ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度考察取同一供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10ul，測(cè)得人參皂苷Rd峰面積的RSD為1.7%，表明本方法精密度良好。

2.6穩(wěn)定性考察取供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，每次10ul，記錄峰面積，計(jì)算人參皂苷Rd的RSD為1.8%，表明供試品溶液在24h穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性考察取同一批樣品5份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份進(jìn)樣10ul，測(cè)得人參皂苷Rd含量的RSD為0.4%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的漢中參葉粉末約0.1g，共5份，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入人參皂苷Rd對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份進(jìn)樣10ul測(cè)定人參皂苷Rd的峰面積，計(jì)算平均回收率99.77%，RSD=1.67%(見表1)。

2.9樣品測(cè)定精密稱取漢中參葉粉末2.0g，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣10ul，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果表明，漢中參葉中人參皂苷Rd含量為0.51%(n=3)。

3結(jié)果與討論

3.1通過實(shí)驗(yàn)研究，建立了漢中參葉中人參皂苷Rd的含量測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)過程分別對(duì)甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-水等的不同配比流動(dòng)相進(jìn)行了的考察，結(jié)果采用乙腈-水(32:64)，峰與相鄰峰均能達(dá)到基線分離，且峰形較好，空白溶劑無干擾。

3.2實(shí)驗(yàn)對(duì)提取方法、提取溶媒、提取時(shí)間等進(jìn)行了考察研究，結(jié)果表明，用甲醇溶液50ml，超聲處理30min，即能提取完全。

3.3由于樣品為地上部分，葉綠素含量很高，因此供試品溶液的純化制備就成為本項(xiàng)的關(guān)鍵之一。實(shí)驗(yàn)過程采用了反復(fù)石油醚萃取除去葉綠素，但還不盡理想，時(shí)有柱壓過高的現(xiàn)象發(fā)生，因此，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)供試品溶液純化制備方法的研究，以保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確穩(wěn)定。

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