大黃特征圖譜研究及游離蒽醌含量測定

【摘要】目的:建立大黃不同炮制品的特征圖譜，對其中5種游離蒽醌類成分進行比較研究。方法:HPLC-DAD法建立大黃的特征圖譜，同時測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種游離蒽醌的含量。流動相甲醇-0.1%HAc水梯度洗脫，檢測波長270nm、420nm，流速0.8ml/min;柱溫25℃。結果:所建立的特征圖譜信息豐富，5個游離蒽醌在測定范圍內線性關系較好(r>0.9999)，平均回收率分別為100.3%、99.55%、96.56%、99.84%、101.3%。結論:不同炮制品其特征圖譜有所差別，游離蒽醌表現出一些規律性的變化。

【關鍵詞】大黃;特征圖譜;游離蒽醌

【中圖分類號】R286.0【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)18-030-2

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palamatum L、唐古特大黃R.tanguticum Maxim exBalf.或藥用大黃R.officinale Bail的干燥根及根莖[1]。神農本草經中記述，大黃味苦寒，歸胃、肝大腸經。大黃具有抗菌、瀉下、止血、抗腫瘤、抗衰老等多種生物活性，臨床上常以不同的炮制品組方入藥發揮不同的功效，如生大黃苦寒沉降瀉下作用為主，酒大黃苦寒瀉下作用緩和，炭大黃具有止血作用。蒽醌類成分是大黃的主要有效成分，在治療疾病過程中起著重要的作用，同時這類成分與其炮制品的功效變化密切相關[2-3]。本實驗以HPLC-DAD法建立了大黃不同炮制品的特征圖譜，并測定了大黃不同炮制品中5種游離蒽醌類成分的含量，比較了這類成分在大黃炮制過程中的變化，以期為大黃的質量控制及臨床應用提供依據。

1儀器與試藥

Agilent1200色譜工作站系統(G1315D型DAD檢測器，G1316A恒溫柱箱，G1312A二元泵，G1322A在線脫氣機，G1329A自動進樣器);超聲清洗器KQ-100(昆山市超聲儀器有限公司);十萬分儀器之一分析天平BP211D(Sartorius賽多利斯科)。甲醇為色譜純(山東禹王)，水為超純水(江蘇省方劑重點實驗室)，使用前均經0.45μm濾膜濾過;其余試劑均為分析純。

對照品大黃酸(110756-200110)、大黃素甲醚(1107

58-200611)購自中國藥品生物制品檢定所，大黃素、大黃酚和蘆薈大黃素由本中藥化學實驗室從大黃藥材中分離鑒定，純度均為98%以上。

樣品:大黃藥材、大黃飲片、酒大黃、大黃炭和熟大黃，各三個批號(080619甘肅禮縣，080620青海，080621四川甘孜)。臨用前分別粉碎過40目篩后備用。

2方法

2.1HPLC-DAD分析條件色譜柱為Agilent Eclipse XDB--C18柱(4.6mm×150mm，5μm);流動相為甲醇(A)-1%HAc(B)水，梯度洗脫[0-8min，10%-20%(A);8-20min，20%-35%(A);20-60min，35%-75%(A);60-75min，75%-100%(A);75-85min，100%-10%(A)];檢測波長270nm、430nm;流速0.8ml/min;柱溫25℃。在430nm下大黃樣品中五種成分分離度好(圖1)。

2.2對照品溶液的制備精密稱取大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、蘆薈大黃素和大黃酸對照品各適量，分別加甲醇制成0.126，0.14，0.133，0.123，0.0505mg/ml的溶液，作為對照品儲備液。于4℃下冷藏，備用。臨用前精密量取上述對照品儲備液各1.8ml，1ml，3.5ml，1ml，2ml加甲醇定容至10ml得到混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備取大黃不同飲片粉末各約0.2g，精密稱定，置于100ml圓底燒瓶中，加50ml甲醇，水浴加熱回流3h，放冷，濾過，用少量甲醇分次洗滌容器及殘渣，合并濾液與洗液，濃縮并定容至10ml量瓶中，搖勻，濾過，取續濾液，以0.45um微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4方法學實驗

2.4.1線性關系考察取上述混合對照品溶液分別進樣1，5，10，20，30uL，依法測定，以進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程:蘆薈大黃素Y=2797.4X-3.8456，r=1.0000;大黃酸Y=2365.5X-7.6227，r=0.9999;大黃素Y=2113.6X-4.7708，r=1.0000;大黃酚Y=3393.5X-8.7039，r=1.0000;大黃素甲醚Y=3091.9X-8.3366，r=0.9999。結果表明蘆薈大黃素在0.0123～0.369ug，大黃酸在0.101～3.03ug，大黃素在0.02268～0.6804ug，大黃酚在0.04655～1.3965ug，大黃素甲醚在0.014～0.42ug線性關系良好。

2.4.2精密度試驗精密吸取混合對照品溶液10uL，連續進樣5次，依法測定，結果測得峰面積的RSD為蘆薈大黃素1.46%，大黃酸0.70%，大黃素2.44%，大黃酚2.96%，大黃素甲醚0.03%。表明儀器精密度良好。

2.4.3穩定性試驗取大黃原藥材粉末(批號:Y080620)，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取5μl，分別在0、3、6、9、12、24h進樣，共進樣6次，計算測得峰面積的RSD為蘆薈大黃素2.18%，大黃酸1.61%，大黃素2.39%，大黃酚2.01%，大黃素甲醚2.10%。結果表明供試品溶液在24小時內基本穩定。

2.4.4重復性試驗取大黃原藥材粉末(批號:Y080620)5份，各約0.2g，精密稱定，按供試品溶液制備方法分別制備供試品溶液，進樣5μl，依法測定并計算含量，結果RSD值分別為蘆薈大黃素2.76%，大黃酸1.91%，大黃素1.88%，大黃酚2.25%，大黃素甲醚1.88%。

2.4.5加樣回收率試驗精密稱定已知含量的大黃原藥材粉末(批號:Y080620)5份，各0.1g，分別精密加入各對照品適量，按供試品溶液制備及測定方法操作，測定結果見表1。

2.5樣品測定取大黃不同來源飲片，依法制成供試品溶液，進液相色譜分析。結果見表2。

3結果和討論

本文以HPLC法建立了大黃的特征圖譜，并對大黃不同炮制品中的5種游離蒽醌進行了含量測定。實驗中曾比較了超聲、回流等提取方法，發現采用回流法提取效率最高。經方法學考察，表明該方法靈敏可靠、重現性好。實驗中還考察了流動相體系(甲醇-0.1%H3PO4與甲醇-1%HAc)和檢測波長(254nm、270nm、430nm)，結果顯示，以甲醇-1%HAc水梯度洗脫，樣品主峰達到較好的基線分離，在270nm處色譜信息最為豐富，在430nm下五種游離蒽醌類成分響應較高，可作為含量測定的檢測波長。

1.大黃藥材2.生大黃3.酒大黃4.大黃炭5.熟大黃

大黃不同樣品的特征圖譜中(圖2)，共有峰表現出大黃不同炮制品的共性，特征圖譜中的非共有峰和峰面積的變化則表現出大黃經炮制后其理化性質和化學組成的變化情況。對甘肅地區大黃不同炮制品的特征圖譜和游離蒽醌的含量測定結果可見，酒制對大黃中的水溶性成分有一定的破壞，熟制結合蒽醌有一部分水解成游離蒽醌，大黃炭水溶性成分以及結合蒽醌破壞均較多，游離蒽醌(除蘆薈大黃素)含量相應增大，且大黃炭>酒大黃>熟大黃(表2)。特征圖譜是通過比較各樣本間色譜圖的差異來反映樣品化學成分間的差異，大黃炮制品特征圖譜不僅存在峰面積的差異，也產生了峰數量的差異，它們反映了大黃各種炮制品內在的質量差別。文獻報道:生大黃結合蒽醌未被破壞，瀉下作用增強;酒大黃經炒后結合蒽醌有所減少，游離蒽醌沒有被破壞，所以具有抗感染作用;熟大黃在蒸制過程中，結合蒽醌減少，瀉下作用緩和;大黃炭炒制后，結合蒽醌被大量破壞，導致瀉下作用極微，具有收斂、止血作用。本試驗中大黃不同炮制品中蒽醌類成分的含量情況與報道基本一致。由圖譜及5種游離蒽醌的含量測定結果可以看出，炮制對大黃中的水溶性成分有一定破壞，結合蒽醌有一部分水解成游離蒽醌，游離蒽醌的峰面積增大，其炮制機理與藥效的關系有待進一步研究。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].北京:人民衛生出版社，2005，145.

[2] 孫玉琦，肖小河.大黃炮制與配伍的化學變化及生物活性表征[D].中國人民解放軍軍事醫學科學院，2006.

[3] 莊江能.大黃的主要成分及其臨床藥理研究進展[J].西南軍醫，2009，11(5):931-933.