基因工程技術在牡丹研究中的應用現狀與展望

霍瑾茹

（北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083）

牡丹（Paeonia suffruticosa），又名富貴花、百兩金、木芍藥、鼠姑、鹿韭，為芍藥科芍藥屬多年生灌木植物，是一種原產于中國西部秦嶺和大巴山一帶山區的傳統名花，享有“花王”的美譽。我國既是牡丹野生種的原產中心和分布中心，又是牡丹園藝品種的栽培中心，擁有四大品種群系。隨著分子生物學的迅猛發展，基因工程技術在牡丹上也得到了較為廣泛的應用。

1 分子標記技術在牡丹親緣鑒定上的應用

我國具有極為豐富的牡丹資源，據初步統計，全國僅栽培的牡丹品種就達800個以上。由于牡丹異花授粉的特性，種間極易雜交，以及長期引種、選擇的結果，已很難單從植物的外部形態上來確定品種的來源、名稱和品種間的親緣關系，常出現同名異種或同種異名的問題，這些都給準確進行牡丹品種資源的篩選、鑒定和利用帶來了困難。關于牡丹品種鑒定，過去幾十年里，研究者在形態學、孢粉學、細胞學等方面做了大量工作。近些年來，許多學者在DNA水平上深入研究牡丹種間、種與品種間及品種群間的相互關系，揭示出形態學無法分析解決的方面。利用DNA分子標記技術，迅速建立起我國牡丹品種的標準指紋圖譜數據庫，對種質資源的快速鑒別、種質資源知識產權保護、園藝植物國際登錄、分子標記育種和優異種質創新等方面將發揮重要作用。

1.1 RAPD技術

利用RAPD技術，陳向明等對35個不同花色牡丹品種親緣關系進行分析，認為來源相同、花色相同的品種間親緣關系相對較近，但多數遺傳組的劃分與花色系列間并未有一致的關系；Hosoki等對19個牡丹品種親緣關系進行分析，得出遺傳聚類組的劃分與花色并不完全一致。孟麗等對11個牡丹野生類群和12個栽培品種親緣關系進行分析，認為與栽培牡丹間親緣關系從近到遠依次為楊山牡丹、四川牡丹、卵葉牡丹、紫斑牡丹和矮牡丹，RAPD試驗擴增出的25個特異標記可用于牡丹組內種間、品種間的分類與鑒定。鄒喻蘋等利用RAPD標記分析了牡丹組種內與種間遺傳關系，結果與洪德元根據形態性狀對該組所做的分類處理基本相符。

1.2 AFLP技術

AFLP（擴增片段長度多態性）作為一種分子標記因其具有帶型豐富、用樣量少、靈敏度高、快速高效等特點，已被用于檢測遺傳多樣性、構建遺傳圖譜和定位克隆基因、天然居群的遺傳結構與保護生物學研究等方面，成為材料間遺傳多樣性和分類研究的有效手段。袁濤對牡丹7個野生種和32個品種的遺傳多樣性和親緣關系AFLP分析結果顯示，野生種的遺傳多樣性明顯高于品種的遺傳多樣性。但是，四川牡丹沒有參與中國栽培牡丹品種群的起源與演化，完全與孟麗的結論不一致。因此，四川牡丹在栽培牡丹品種群的起源與演化中的地位尚不清楚.侯小改發現與革質花盤亞組與栽培牡丹親緣關系從近到遠的4個種依次為：楊山牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹和卵葉牡丹，且矮牡丹和卵葉牡丹有較近的親緣關系，但缺乏四川牡丹。侯小改將30個牡丹品種完全區分開，多數選育地相同的牡丹種質表現出較為密切的親緣關系。當其他性狀相差不大時，株高相近的品種間親緣關系相對較近。李保印等利用AFLP技術對中原牡丹品種建立了由60個樣本組成的核心種質。

1.3 SRAP技術

相關序列擴增多態性（SRAP）是一種新型的基于PCR的標記方法，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros提出。該標記通過獨特的引物設計對可讀框（open reading frames，ORFs）進行擴增，因個體不同以及物種的內含子、啟動子與間隔區長度不等而產生多態性。該標記將AFLP和RAPD兩者的優點有機的結合起來，具有簡便、穩定、產率高、便于克隆目標片段的特點。SRAP標記是對基因的重要組成部分ORFs進行擴增，基因的多樣性更能反映遺傳資源的多樣性，SRAP標記在這方面的應用較為廣泛。

HAO等對29個品種的牡丹進行研究表明，SRAP標記是非常有效的識別牡丹品種和雜交種的標記方法。其鑒定結果與形態觀察的結果一致，且操作簡便，可大大降低引物合成費用，提高引物的使用效率。郭大龍等對影響牡丹SRAP反應的各因子進行正交試驗，得到牡丹最佳的反應體系和反應程序，為SRAP技術在牡丹育種上的應用奠定了基礎。

2 基因工程技術在控制牡丹種質創新上的應用

牡丹的花期較短，且花期較集中，給牡丹花會的舉辦和人們賞花帶來不便，如何延長牡丹花期成為迫切需要解決的問題。牡丹花屬乙烯敏感型，乙烯的大量產生是牡丹花衰老的主要原因。在高等植物體內乙烯的生物合成是由前體物質SAM（S一腺苷甲硫氨酸）在ACS（ACC合成酶）和ACO（ACC氧化酶）的催化下形成的，ACS和ACO是乙烯生物合成過程中的2個關鍵酶。通過ACC氧化酶的反義基因技術，可望有效抑制乙烯生成，從而延長牡丹花期。楊英軍等通過PCR擴增，已獲得長度約500 bp的片段，經測序發現該片段與已知序列同源性為98.2%，表明牡丹ACC氧化酶基因部分序列克隆成功。進一步將克隆到的牡丹ACC氧化酶片段與植物表達載體pBI 121反向連接，并轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，成功構建了牡丹ACC氧化酶基因的反義表達載體，為進一步通過反義技術獲得抗衰牡丹資源奠定了基礎。

3 展 望

基因工程技術在牡丹研究中的應用已取得了較大進展，但廣度和深度還有待擴大。國內牡丹分子水平的研究主要集中在品種間親緣關系的研究，在農作物育種及轉基因花卉方面的研究及應用尚處在起步階段。

傳統的育種手段已遠遠滿足不了人們對于牡丹色、香、花期等的新品種需求。由于牡丹組織再生及組培苗馴化存在諸多困難，目前尚無法運用農桿菌介導和基因槍轉化法進行牡丹轉基因技術研究。

自1987年Meyer獲得轉基因矮牽牛以來，花卉基因工程迅速發展，并已成為花卉育種的新趨勢.花卉基因工程通過抑制內源基因或導人外源基因而定向改造特定性狀且不喪失原有性狀，大大縮短了新品種選育的時間；而且可以突破種間不親和的限制，將目的基因引入原來沒有這種基因的物種，從而極大地改良花卉品質，甚至創造新品種。

近年來發展的花粉管通道法轉基因技術避開了再生的障礙且操作簡單，已在小麥、大豆等作物上獲得成功。花粉管通道法轉基因技術的不斷成熟為牡丹性狀的分子改良提供了一條全新的思路。花粉管通道法轉基因技術是現階段一種潛在的適宜于牡丹的轉基因方法。花粉管通道在花柱中的形成是進行花粉管通道法轉基因的前提。花粉管在花柱中的生長速度因植物種類的不同而差異很大，明確牡丹花粉管形成所需時間，對于牡丹花粉管通道法轉基因技術研究是十分必要的。

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