聯合生物加工工藝生產乙醇的研究展望

翁海波，王志強，敬蔚然

（鄭州大學生物工程系，河南 鄭州 450001）

能源是人類社會賴以生存和發展的重要物質基礎。隨著世界人口的增加以及各國工業化水平的提升，整個社會對能源的需求量與日俱增。應用生物能源轉化技術可將生物質轉變為清潔能源，能緩解石油、天然氣等不可再生化石能源日漸枯竭帶來的能源壓力。目前生物轉化使用的原料是玉米等糧食作物，但是這些原料的大量使用會影響到糧食安全，所以秸稈、麩皮、鋸木粉等農業、工業廢棄物等含有大量的木質纖維素，將是很有潛力的乙醇發酵原料。另外，生物燃料的生產過程中，纖維素的預處理和纖維素酶的生產成本較高[1-2]。因此減少預處理，增強纖維素酶的活性，提高發酵產物的產量和純度，減少中間環節也是降低生產成本的途徑。

聯合生物加工（consolidated bioprocessing，CBP）不包括纖維素酶的生產和分離過程，而是把糖化和發酵結合到由微生物介導的一個反應體系中，因此與其他工藝過程相比較，底物和原料的消耗相對較低，一體化程度較高[3]。本文主要討論CBP的概念，可行性和策略，以及真菌的應用和發展前景。

1 CBP的可行性和必要性

應用聯合生物加工是可行的。有關熱纖梭菌利用纖維素的研究為CBP可行性提供了實驗證據。生理學研究和14C標記的纖維素實驗說明，生長于纖維素上的微生物的生物能量效益取決于胞內低聚糖攝取過程中β-糖苷鍵磷酸解的效率，并且這些效益超過了纖維素合成的生物能量成本[3-4]。這些研究為纖維素分解菌在纖維素上快速生長提供了實驗依據和理論依據。

以酶-微生物復合體存在比纖維素酶復合體單獨存在時纖維素酶的作用效率要高。在厭氧菌中，酶-微生物復合體的協同作用在降解纖維素時處于中心地位。然而，以產纖維素酶為特征的工業生產中卻不添加活體纖維素裂解菌。應用以酶-微生物復合體為作用特征的CBP工藝將是必要的，是未來的研究方向。

2 CBP的策略

應用聯合生物加工的關鍵是構建出能完成多個生化反應過程的酶系統，使纖維素原料通過一個工藝環節就轉變為能源產品。一些細菌和真菌具有CBP所需要的特性，所以改造現有的微生物已成為研究的熱點。以基因重組等為代表的生物工程技術已經使這種設想成為現實，并為設計出更完善的CBP酶系統提供了可能。對相關的微生物改造主要有以下3個策略。

2.1 天然策略

天然策略是將本身可產生纖維素酶的微生物，尤其是厭氧微生物進行改造，使其適應CBP生產的要求。這種策略關鍵在于，提高對乙醇的耐受力，減少副產物的生成，導入新的代謝基因將糖化產物全部或者大部分進行發酵，從而產出高濃度的乙醇。有研究者對耐乙醇嗜熱菌株的進行了篩選和改造[5]，所得的菌株能在60 g/L的乙醇濃度下生長，乙醇耐受性能滿足CBP工藝的要求。另外，對嗜熱菌和大腸桿菌來說，副產物如有機酸及其鹽抑制作用更強，缺少有機酸將會使乙醇的濃度顯著升高[6]。如敲除熱解糖梭菌的有機酸合成基因，結果未檢測到無機酸，而檢測到較高產量的乙醇[7]。另外通過電轉化的方法，在解纖維梭菌和熱纖維梭菌中，實現了異源纖維素酶基因轉移和表達。

2.2 重組策略

重組策略是通過基因重組的方法表達一系列的外切葡聚糖酶和內切葡聚糖酶等纖維素酶基因，使微生物能以纖維素為唯一碳源，將來源于纖維素的糖類完全或者大部分進行發酵。這方面的微生物有大腸桿菌，畢赤酵母，釀酒酵母等[8-9]。重組策略方面的研究取得了一定的成果。不同菌株所編碼糖苷水解酶（如纖維素酶，半纖維素酶，β-D-半乳糖苷酶），木聚糖降解酶，阿拉伯糖降解酶的基因已經被導入釀酒酵母。能在纖維素，半纖維素，纖維二糖，木聚糖，阿拉伯糖上生長的工程菌也有報道。

重組策略所遇到的問題有：（1）外源基因共表達對細胞的有害性。如在釀酒酵母中導入大量的外源基因可能導致基因表達不穩定和對細胞表面產生其他不利影響。（2）需要在轉錄水平使外源基因適量表達。如在釀酒酵母中，里氏木酶的纖維二糖水解酶Ⅰ基因需要高水平表達以保證所需要的酶活性，但其他的一些外源基因不需要太高的表達。這需要研究如何利用酵母的調控蛋白，找到合適不同基因的啟動子和轉錄調控元件，準確的調節不同基因的表達量。（3）一些分泌蛋白可能折疊不正確。纖維素降解蛋白合成之后必須要正確折疊才能分泌并行使功能。未正確折疊的蛋白分泌后要通過內質網結合蛋白降解，而且對內質網造成壓力[10]。需要更進一步的了解酵母內質網降解機制和非折疊蛋白反應機制，以使所有的纖維素降解酶都能穿過內質網，正確地折疊，行使相應的功能。

2.3 共培養策略

纖維素糖化液含有葡萄糖，麥芽糖，乳糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖等多種糖分，利用共培養法能提高發酵效率。共培養策略有兩層含義：一是指發酵液中存在的不同的類型的微生物，利用廣泛類型的糖類底物。例如將僅能利用己糖的熱纖維梭菌與能利用戊糖的微生物進行共培養。這能避免不同生物間的底物競爭，實現乙醇產量最大化。二是指存在不同特性的微生物相互協作，加強發酵效果。如Kohji Miyazaki等將好氧菌和厭氧菌共發酵，提供了發酵過程中的協同模型[11]。Shrestha等用白腐菌在37℃下，對玉米纖維進行1～3 d的預處理，發現用釀酒酵母和白腐菌共培養發酵玉米纖維會產生更多的乙醇，每100 g玉米纖維產3 g乙醇[12]。建立穩定的共培養體系是個復雜的過程，要考慮培養基，生長條件，以及菌株間的代謝關系。穩定結構的細菌群體的標準是各種生物的生物量在傳代后不會有大的變化并且能夠至少傳代20次。

3 里氏木霉在CBP上的應用研究

3.1 里氏木霉的特點

里氏木霉有兩個生物合成體系：一種是在有氧條件下產纖維素酶系統，另一種是厭氧條件下產乙醇的酶系統。它有多種優點。（1）相對于其他的微生物，里氏木霉能產生更足量的酶。研究表明，以可溶性糖（葡萄糖和木聚糖）為底物，里氏木霉的乙醇產量低于其他真菌，但以纖維素為底物比其他的絲狀真菌的乙醇產量高[13]。這可能是由于里氏木霉有很強的分泌系統，并且能產生大量的纖維素降解酶。如細胞溶膠中的內質網和高爾基體能產生和分泌復雜結構的酶，如纖維二糖水解酶Ⅰ，而細菌沒有這些分泌系統。（2）里氏木霉能在低成本的培養基上生長。（3）能利用木質纖維素糖化產生的所有的糖類產乙醇。（4）里氏木霉能產β-D-葡（萄）糖苷酶將纖維二糖轉化為葡萄糖，解除代謝初產物纖維二糖對纖維素酶活性的抑制[14]。里氏木霉的這種基本特征決定著它在CBP中將有廣泛的應用。

3.2 提高乙醇產量的策略

3.2.1 提高乙醇耐受力 耐受乙醇要通過以下策略優化：（1）乙醇耐受基因的鑒定和修飾。（2）導入其他基因。如釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶來增強乙醇合成。（3）敲除副產物的相關基因。高濃度的乙醇能改變細胞膜上的受體蛋白，阻遏糖酵解和代謝循環，最終抑制細胞的生長和發酵。許多證據表明，乙醇耐受基因不是單一的基因，全轉錄工程提供了一個新方法。例如分別通過三種轉錄調控因子基因的突變，釀酒酵母的乙醇耐受力有所提高[15]。

3.2.2 提高糖轉運效率 糖類不能自由地穿過細胞膜，微生物是通過特定的糖轉運蛋白來利用糖類，所以了解糖轉運機制是必要的。轉運蛋白作為培養基中糖濃度的“感受器”，可產生相應的胞內信號.不同的糖轉運蛋白在不同的濃度下行使功能，從而使微生物在較廣的范圍內利用糖類。已有里氏木霉的糖轉運蛋白的研究報道[16]，對轉運蛋白的深入研究，可以使轉運蛋白在低糖濃度下對糖類的親和力較高，使糖類更好的被利用?？梢杂心康牡靥岣咿D運蛋白的數量，可以表達多種糖類的轉運蛋白，以盡可能多的利用生物質產生的糖類。

4 研究展望

隨著化石能源的減少，尋求清潔能源將是未來的普遍做法。利用乙醇作為清潔燃料將會帶來經濟效益和環境效益。目前我國的乙醇主要由甘蔗、玉米等糧食生產，因此受到原料價格和來源上的限制。CBP具有明顯降低乙醇生產成本的潛力，越來越多的文獻也證明了其可行性，為低成本生產乙醇提供了有效的工藝。纖維素降解菌里氏木霉能夠分泌一系列酶將木質纖維素分解為糖，并能最終發酵為乙醇。在這方面的研究必將使低成本的生物質能源轉化技術實現跨越式的發展，并帶來可觀的社會效益。

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