131I標記抗Peroxiredoxin I肺腺癌噬菌體抗體在荷瘤裸鼠體內的分布及其對腫瘤生長的抑制作用

李淑杰，羅弋，龐華，李少林

（重慶醫科大學1.放射醫學教研室，分子醫學與腫瘤學研究中心，重慶 400016；2.附屬第一醫院核醫學科，重慶 400016）

Prx I是過氧化物酶（peroxiredoxins，Prxs）的2-Cys亞家族成員，定位于細胞質，在肺腺癌細胞中高表達［1］。Prx I可減少活性氧自由基的產生，其表達上調可增強腫瘤抗氧化能力，是腫瘤抗凋亡和耐藥的重要原因［2］，可作為肺癌治療的靶點［3］。

完全人源化的噬菌體抗體作為第三代基因工程抗體的代表，克服了傳統抗體的異源性、血清清除速率慢［4，5］、療效較低及制備工藝復雜等弊端，為腫瘤的抗體診斷和治療帶來新的選擇。本研究以Prx I為靶點，利用噬菌體展示技術制備人源化肺癌抗體，并偶聯放射性核素，進行抗體放免顯像及治療的研究，為進一步臨床抗體制劑開發和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

抗Prx I肺腺癌噬菌體單鏈抗體為本實驗室自行制備［6］；人肺腺癌A549細胞株購自中科院上海細胞庫；BALB/c裸鼠，SPF級，雄性，體質量20～26 g，4～6周齡，購自重慶醫科大學動物中心；peroxiredoxin I抗原購自美國BPS公司；兔抗人Prx I多抗購自英國ABCAM公司；HRP/羊抗兔IgG二抗購自美國SAB公司；放射性核素Na131I、Na125I均購自中國原子能科學研究院；SN-684型放射免疫γ計數儀為上海核所日環光電儀器有限公司產品；SPECT顯像儀器采用德國SIEMENS Symbia T2 SPECT儀。

1.2 可溶抗體細胞內攝量測定

氯胺T法125I標記抗體并純化。肺腺癌A549細胞中加入125I-scFv（1.5×106cpm/1×104cells），37 ℃孵育30 min和120 min，以4℃孵育細胞為對照，各做3次。孵育結束后分別PBS液洗滌細胞3次，再以冰預冷甘氨酸緩沖液（0.1 mol/L glycine-HCl，2 mol/L urea，pH2.2）洗3 次，每次2min，以洗脫細胞表面結合的125I-scFv，收集洗脫液。再以2%SDS溶解細胞，收集溶胞產物。分別用γ計數儀測洗脫液和溶胞產物放射性計數。

1.3 細胞生長抑制檢測

將 A549細胞（3×104/ml）接種 96孔板（100 μl/well），設立空白對照組，各組3個復孔。72 h后行MTT法檢測（490 nm）細胞增殖情況。

將 A549細胞（1×106/ml）接種于培養瓶，培養液體積1ml。加入1ml scFv（0.5 μmol/L）。72 h 后消化細胞，用Annexin V-FITC/PI雙染法上流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.4 A549細胞Prx I蛋白表達

將A549細胞（5×106/ml）接種培養瓶培養。加入1 ml scFv（0.5 μmol/L）。設空白對照（以PBS替代scFv抗體）。72 h后Western blot檢測Prx I蛋白表達水平，以兔抗人Prx I多抗為一抗，HRP/羊抗兔IgG為二抗。計算Prx I蛋白條帶與β-actin內參條帶光密度比值，以其表示Prx I蛋白表達的相對強度。

1.5 scFv的131I標記及鑒定

氯胺T法標記抗體后將標記反應液注入1×15 cm Sephadex G200柱，用0.01 mol/L PBS洗脫純化。三氯醋酸沉淀法計算標記率。以正丁醇和乙酸混合液為展開劑，紙層析法測定標記物的放射性化學純度和比活度。

1.6 荷瘤裸鼠模型的建立

對數生長期肺腺癌A549細胞以5×106cell/200 μl濃度接種于裸鼠右前肢后方皮下。觀察生長情況，待腫瘤直徑長至0.7～1.0 cm時用于下一步實驗。

1.7 生物分布測定

每只荷瘤裸鼠尾靜脈注射131I-scFv200 μl（約18.5 MBq），共注射12只，并隨機分為4組。分別于注射后12 h、24 h、48 h和72 h處死各組裸鼠，剝離腫瘤組織及主要器官，稱質量，用γ計數儀測定放射性計數，計算每克組織百分注射劑量率（%ID/g）。

1.8 放射免疫顯像

取3只荷瘤裸鼠，注射131I-scFv前3 d以1%KI封閉甲狀腺。每只裸鼠分別于尾靜脈注射200 μl新鮮配制的131I-scFv（約18.5 MBq）。將裸鼠固定后在注射核素標記抗體后12 h、24 h、48 h和72 h分別進行SPECT顯像。儀器采用高分辨準直器，距陣256×256，能峰364 keV，計數25 K-30 K，2倍放大。以腫瘤部位對側組織為感興趣區（region of interest，ROI），測定靶器官/周圍組織（T/NT）值。

1.9 荷瘤裸鼠分組治療觀察

將15只荷瘤裸鼠隨機分為3組：生理鹽水對照組（注射生理鹽水0.1 ml）、131I-IgG治療組（注射131IIgG約20 MBq）和131I-scFv治療組（注射131I-scFv約20 MBq），1次/2 d，共14次。游標卡尺每3 d測量一次腫瘤最大直徑（a）和最大垂直直徑（b）。4周后處死裸鼠，剝離腫瘤組織、稱重，計算抑瘤率IR=（Vo-Vn）/Vo×100%，Vo為對照組腫瘤體積，Vn為治療組腫瘤體積。4周后處死各組裸鼠，剝離腫瘤組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋后作病理切片，HE染色后觀察病理學改變。

1.10 統計學處理

2 結果

2.1 A549細胞內攝可溶抗體

溶胞產物的放射性計數評估細胞內攝125I-scFv量，甘氨酸洗脫液和溶胞產物總和的放射性計數評估細胞結合125I-scFv的總量。經γ計數儀測定，120 min時間點細胞結合抗體的總量及內攝量均為30 min時間點的2倍。內攝抗體量占細胞總結合抗體量的比例在2個時間點保持相對穩定，分別為40.3%（30 min）和 44.7%（120 min）。

2.2 MTT法及流式細胞術評價細胞生長、凋亡情況

單鏈抗體scFv作用于A549細胞72 h后進行MTT分析。可見scFv對細胞有劑量依賴的抗增殖作用（圖1）。AnnexinV-FITC/PI法流式細胞儀檢測A549細胞凋亡，scFv干預組細胞凋亡率較對照組明顯增加（圖2）。

2.3 Prx I蛋白表達水平測定

可溶單鏈抗體scFv干預A549細胞72 h后，提取總蛋白，進行Western blot檢測。可見樣品組Prx I蛋白表達水平低于空白對照組（P＜0.05）（圖3）。結果證實可溶抗體scFv干預后細胞Prx I蛋白表達受到抑制。

2.4 131I-scFv的標記結果

三氯乙酸沉淀法測得131I-scFv標記率為（83.2±6.5）%。131I-scFv的放射化學純度為（95.6±3.7）%，比活度為（2.8±0.2）MBq/μg。

2.5 131I-scFv在荷瘤裸鼠體內的分布

測定12只荷瘤裸鼠腫瘤、血液、肝、腎、脾、腸、肌肉等器官組織的放射性。在48 h腫瘤攝取131I-scFv抗體量達（3.78±0.65）%ID/g。此時瘤/血放射性比值和瘤/肌肉放射性比值均達最大值，分別為4.06±0.13 和5.17±0.97。

2.6 放射免疫顯像

結果顯示，腫瘤部位有放射性核素濃聚，可見腫瘤清晰顯像。勾畫ROI，計算T/NT值。12h、24 h、48 h 和 72 h 分別為1.26±0.15、2.18±0.16、3.73±0.20 和2.85±0.18。48 h顯像的T/NT值明顯高于其他時間點（F均＞86，P 均＜0.01），且腫瘤顯示最清晰（圖4）。

2.7 各組裸鼠治療效果比較

治療4周后131I-scFv組腫瘤質量［（2.37±0.58）g］、體積［（1.36±0.33）cm3］較其他2組有明顯降低，抑瘤率56.8%，抑瘤作用明顯，而其他2組間無明顯差異。將各組腫瘤切片后HE染色鏡下觀察。與空白對照組比較，131I-scFv治療組腫瘤切片可見大片腫瘤細胞壞死，核碎裂、核溶解明顯，細胞間質呈紅染無結構物質（圖5）。

3 討論

噬菌體抗體以其制備簡便、可以規模化生產及完全人源化的優勢，在臨床腫瘤治療中成為新的選擇和補充［7，8］。經檢測，本實驗室前期制備的抗Prx I肺腺癌噬菌體單鏈抗體與高表達Prx I的肺腺癌A549細胞有較強的特異性結合活性，為抗體的體內分布及抑瘤作用研究提供了保證。

因為抗體庫的篩選是在體外以腫瘤細胞及純化的Prx I作為靶抗原進行的，因此有必要在體內對抗體結合高表達Prx I肺腺癌組織的能力進行檢測。本研究觀察到抗體在腫瘤部位得到有效濃聚，而腸、肝及腎臟對抗體的攝取也較高。在注射后12 h，瘤/血比值和瘤/肌肉比值分別是0.77和1.65，并且在第48 h均達到最大值，分別為4.06和5.17。SPECT也提示相同的結果，注射后12 h時胃腸和腎臟是主要的非特異性攝取器官，但隨著注射后時間的延長，腫瘤部位顯像越來越清晰，而到第48 h時腫瘤顯像最為清晰，非特異性攝取明顯減少。并且由于代謝的原因，此時腫瘤顯像較第72 h時更為清晰。

抗體的治療作用研究是接下來需要考察的內容。已有研究表明，噬菌體單鏈抗體與細胞表面分子的結合內攝可介導腫瘤細胞重要的生理進程，具有內在的抗增殖活性［9］。我們的前期研究中，采用肺腺癌患者癌旁淋巴結組織作為抗體基因來源，制備得到了特異性較好的抗Prx I肺腺癌相關噬菌體抗體。在本研究的體外抑制肺腺癌細胞生長實驗中，證實了單鏈抗體與A549細胞結合后能被有效內攝進入細胞內，并介導了劑量相關的抗腫瘤細胞增殖效應，觀察到靶細胞凋亡的增加，以及細胞內Prx I蛋白表達量的下降。基于以上結果，可以推測抗體的抗增殖作用是因為內攝的抗體限制了細胞受體數量，并且在與Prx I表位結合后，降低了腫瘤細胞的抗氧化能力，從而促進了細胞的增殖抑制和凋亡。關于該抗體抑制肺腺癌細胞生長的機制，需要進一步的深入研究。在荷瘤裸鼠模型進行的核素標記抗體放免治療實驗中，通過靜脈給藥，也同樣觀察到腫瘤體積和質量的減小，證實了131I標記單鏈抗體用于放免治療的可行性和有效性。

噬菌體單鏈抗體作為最具應用潛力的治療性抗體，在腫瘤抗體治療中揮發日益重要的作用。本研究利用以肺腺癌細胞及其高表達的Prx I作為治療靶點的噬菌體抗體進行抗體體內分布及抑瘤作用研究，證實抗體具有良好的藥代動力學特性，與131I標記后能有效抑制肺腺癌腫瘤的生長，具有進一步開發制備腫瘤放免顯像及治療藥物的應用潛力。

［1］Chang JW，Lee SH，Jeong JY，et al.Peroxiredoxin I is an autoimmunogenic tumor antigen in non-small cell lung cancer［J］.FEBS Lett，2005，579（13）：2873-2877.

［2］Chang JW，Jeon HB，Lee JH，et al.Augmented expression of Peroxiredoxin I in lung cancer［J］.Biochem Biophy Res Commun，2001，289（2）：507-512.

［3］Kim JH，Bogner PN，Baek SH，et al.Up-regulation of peroxiredoxin1in lung cancer and its implication as a prognostic and therapeutic target［J］.Clin Cancer Res，2008，14（8）：2326-2333.

［4］Xiao J，Horst S，Hinkle G，et al.Pharmacokinetics and clinical evaluation of125I-radiolabeled humanized CC49 monoclonal antibody（HuCC49deltaC（H）2）in recurrent and metastatic colorectal cancer patients［J］.Cancer Biother Radiopharm，2005，20（1）：16-26.

［5］Weiner LM.Fully human therapeutic monoclonal antibodies ［J］.J Immunother，2006，29（1）：1-9.

［6］羅弋，龐華，李少林，等.人源抗Peroxiredoxin I肺腺癌噬菌體抗體的制備及鑒定［J］.南方醫科大學學報，2010，30（1）：30-34.

［7］Yamashita T，Utoguchi N，Suzuki R，et al.Development of anti-tumor blood vessel antibodies by phage display method ［J］.Yakugaku Zasshi，2010，130（4）：479-485.

［8］Majidi J，Barar J，Baradaran B，et al.Target therapy of cancer：implementation of monoclonal antibodies and nanobodies ［J］.Hum Antibodies，2009，18（3）：81-100.

［9］Liu B，Conrad F，Cooperberg MR，et al.Mapping tumor epitope space by direct selection of single-chain Fv antibody libraries on prostate cancer cells［J］.Cancer Res，2004，64（2）：704-710.