一個低磷酸酶血癥家系的基因突變分析

陳晨，王麗波，曹麗華，邢雪莎，王述森，麻宏偉，羅陽

（中國醫科大學 1.基礎醫學院醫學基因組學教研室，沈陽 110001；2.附屬盛京醫院發育兒科，沈陽 110004）

低磷酸酶血癥（hypophosphatasia）是一種罕見的遺傳性疾病，以骨骼和牙齒礦化缺陷，血清和骨堿性磷酸酶活性持續低水平或缺如為主要特征。目前對本病尚無有效的治療方法。低磷酸酶血癥是由于肝/骨/腎堿性磷酸酶基因（alkaline phosphatase，liver/bone/kidney，ALPL；MIM#171760） 突變所致，ALPL基因定位于1p36.1［1］，編碼的蛋白是組織非特異性堿性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNAP）。該病的遺傳方式較為復雜，呈常染色體顯性或隱性遺傳。本研究采集了一個低磷酸酶血癥家系中1例低磷酸酶血癥的患兒及其患病母親的血樣，采用PCR結合基因測序的方法尋找患者及其母親的ALPL基因突變位點，進一步確認臨床診斷，同時探討患者發病的機制。

到漢武帝劉徹即位時，西漢儲備的糧食層層積壓，導致倉庫爆棚；國庫里銅錢積壓太多，導致穿錢的繩子朽壞，銅錢散落無法計算。有錢就任性的劉徹，終于敢對匈奴人說“不”了。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究由中國醫科大學附屬盛京醫院發育兒科提供家系成員外周靜脈血及病例資料，系譜圖見圖1。共采集到該家系中Ⅳ-1和Ⅲ-2兩名成員的血樣，先證者Ⅳ-1為2009年就診于盛京醫院的患者，男，3.5歲，以“腿彎3年”為主訴就診，Ⅲ-2為先證者母親。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢查：查體發現先證者Ⅳ-1身高96.5 cm（-1SD），“O”型腿，雙膝間距5 cm。實驗室檢查中Ⅳ-1血堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）95.5 U/L（參考值40~375 U/L），血鈣、磷、鎂、甲狀旁腺素水平均正常。X線檢查發現雙側股骨頸干角變小，股骨頸略短，雙側髖內翻，見圖2。Ⅲ-2的血ALP為19.5 U/L（參考值40~150 U/L），其他檢查結果正常。

2～5歲兒童的皮膚發育過程具有一定的特殊性，其皮膚含水比例高， 在不同環境中的水分喪失速度較快，同時皮膚層內的脂質含量偏低，容易受到自身免疫性因子或者外界病原體的感染而出現真皮層的病變[4]。2～5歲兒童的發病率在不同的年齡階段中處于較高水平[5-6]，部分東部沿海省份的相關流行病學研究顯示，2～5歲兒童不同類型皮膚疾病的總體發病率占到了其年齡段的第一位[7]。而皮膚病對于2～5歲兒童具有下列幾個方面的主要影響[8-9]：①對于兒童自信心的培養具有較為顯著的影響，增加了患兒自卑或者遠期抑郁及焦慮的風險；②導致患兒對于學習興趣的下降，影響到了其學習成績及自身性格的形成。

1.2.2 提取基因組DNA：取患者Ⅳ-1和Ⅲ-2枸櫞酸鈉抗凝處理的外周靜脈血各200μl，選用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（TaKaRa）試劑盒提取基因組DNA，置于-20℃保存。

將患者Ⅳ-1的ALPL基因雙向測序結果分別進行序列比對分析（Human BLAT Search，http：//www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat），發現患兒第12外顯子存在一個雜合突變c.1366G>A（p.G456R），即cDNA第1 366位G突變為A，導致456位的甘氨酸變為精氨酸，見圖3。對患者母親ALPL基因第12外顯子進行測序分析，結果顯示患者母親Ⅲ-2存在相同的雜合突變。

2 結果

1.2.3 PCR擴增候選致病基因ALPL的外顯子并進行測序分析：在UCSC網站獲得ALPL基因的DNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計覆蓋該基因編碼區（包括外顯子和內含子交界區）的引物，引物序列見表1。首先對先證者Ⅳ-1進行檢測，PCR擴增該基因的 12個外顯子，PCR反應體系為 2×GC Buffer I （Mg2+Plus）25 μl，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L）8 μl，上下游引物終濃度為 0.5 μmol/L，TaKaRa LA Taq 2.5 U，基因組 DNA約 200 ng，加ddH2O至50μl，PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠純化后對PCR產物進行測序分析。測序結果利用UCSC數據庫對測得的DNA序列進行核酸序列的同源性比對分析。在先證者基因水平檢測到突變后，同樣通過測序分析方法驗證家系內其他患者是否存在相同位點的基因突變。

3 討論

低磷酸酶血癥是一種以骨礦化缺陷和組織非特異性堿性磷酸酶（TNAP）活性減低為主要特征的遺傳性疾病，目前尚無根治方法，雖然有報道可以用自體間充質干細胞進行基因替代治療［2］，但有效率和安全性尚待確定，因此基因診斷和遺傳咨詢顯得更為重要。低磷酸酶血癥致病基因ALPL定位于1p36.1，共包含12個外顯子，編碼524個氨基酸。參照人類基因突變數據庫（Human Gene Mutation Database，HGMD）和國外學者建立的低磷酸酶血癥基因突變數據庫（http：//www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php），到目前為止共報道了ALPL基因的218個突變，絕大部分為錯義突變，大約占79.3%，且突變主要集中在第5~6外顯子和第9~12外顯子。本研究中檢測到的該家系的p.G456R的雜合突變，位于第12外顯子，Ozono等［3］曾經報道過該突變并對其進行體外重組實驗研究，結果顯示p.G456R突變體導致堿性磷酸酶完全失去活性。

在蔡家堡鄉、西山鄉、東山等鄉鎮建立馬鈴薯“青薯2號”“青薯9號”全膜覆蓋栽培技術標準化示范區80hm2，平均產量3.58×104kg，總產量達286.4×104kg；實現收入3.22萬元·hm-2，總產值257.76萬元(按0.9元/kg計算)；與露地常規栽培相比，增產0.85×104kg，增產率31.14%，增收0.77萬元·hm-2；新增產量68.0×104kg，新增產值61.2萬元。

ALPL基因編碼的TNAP蛋白共分為4個功能區域，分別是冠區、酶激活位點、同源二聚體界面和鈣結合位點，該蛋白通過形成同源二聚體而發揮活性。第456位的氨基酸靠近TNAP的同源二聚體界面，并且在哺乳動物中是十分保守的氨基酸，該位點由極性疏水性的甘氨酸變為堿性的精氨酸，很可能影響TNAP的蛋白結構和活性，因此初步認為p.G456R是該家系中患者疾病表型的關鍵影響因素。根據患者Ⅳ-1和Ⅲ-2的年齡和生化檢查等臨床表現，兩者在臨床表型上都屬于輕型，輕型低磷酸酶血癥可呈常染色體顯性或隱性遺傳。而在該家系中，根據系譜圖可知，疾病在該家系中呈常染色體顯性遺傳，這與患者測序分析只檢測到一個雜合基因突變的結果吻合。根據文獻報道，檢測到一個突變等位基因的輕型低磷酸酶血癥患者多是（76.6%）由于雜合突變的顯性負效應致病［4~6］，而本研究中的p.G456R接近TNAP蛋白同源二聚體界面，因此推斷本家系更可能是由于雜合突變的顯性負效應，即影響了正常二聚體的形成而致病，其具體機制有待進一步研究。

表1 擴增ALPL基因外顯子的引物序列Tab.1 Primer sequence of ALPL gene exons

本研究在中國人群中首次報道了一個低磷酸酶血癥家系ALPL基因編碼區的雜合錯義突變c.1366G>A，進一步豐富了基因突變數據庫，有助于深入了解該基因的結構與功能，同時也確認了患者的臨床診斷，為該家庭的遺傳咨詢和產前診斷提供了可靠的依據。

［1］Mornet E.Hypophosphatasia［J］.Orphanet JRare Dis，2007，2：40-47.

［2］Katsube Y，Kotobuki N，Tadokoro M，et al.Restoration of cellular function of mesenchymal stem cells from a hypophosphatasia patient［J］.Gene Ther，2010，17（4）：494-502.

［3］Ozono K，Yamagata M，Michigami T，et al.Identification of novel missense mutations（Phe310Leu and Gly439Arg）in a neonatal case ofhypophosphatasia［J］.JClin Endocrinol Metab，1996，81（12）：4458-4461.

［4］Delphine F，Isabelle B，Anne-Sophie L，et al.Mild forms of hypophosphatasia mostly result from dominant negative effect of severe allelesor fromcompound heterozygosity for severeand moderatealleles［J］.BMCMed Genet，2009，6（10）：51-59.

［5］Muller HL，Yamazaki M，Michigami T，et al.Asp361Val mutant of alkaline phosphatase found in patients with dominantly inherited hypophosphatasiainhibitstheactivityof thewild-typeenzyme［J］.JClin Endocrinol Metab，2000，85（2）：743-747.

［6］Lia-Baldini AS，Muller F，Taillandier A，et al.A molecular approach todominancein hypophosphatasia［J］.Hum Genet，2001，109（1）：99-108.