腺病毒載體影響大鼠催乳素細胞增殖功能的機制初探

王振華，劉云會，薛一雪

（中國醫科大學 1.基礎醫學院生理學教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1；2.附屬盛京醫院神經外科，沈陽 1 1 0 0 0 4；3.基礎醫學院神經生物學教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1）

近年來，腺病毒載體介導的基因轉移已經被廣泛應用于人類疾病的基因治療中。它具有安全性較好且轉染率高等優點，但其應用在某些科學領域也存在一定的局限性，例如體外轉染腺病毒載體可干擾原代培養的某類細胞的一些特定功能。有文獻報道，表達β半乳糖苷酶（βgal）基因的腺病毒載體以20 MOI的劑量轉染原代培養的垂體前葉細胞，將影響該細胞激素的分泌及細胞增殖［1］。在原代培養的牛腎上腺皮質等細胞中，攜帶某種基因的腺病毒載體也會不同程度地改變這些細胞分泌激素等功能［2］。盡管腺病毒載體已成功用于在體或離體培養的內分泌細胞的基因轉移，尤其是垂體前葉細胞［3，4］，但鮮有在內分泌細胞中轉染腺病毒載體效應的報道。如果腺病毒載體本身對靶細胞的功能產生影響，將使腺病毒載體的應用嚴重受限。因此，了解腺病毒載體和靶細胞的相互作用對于腺病毒載體的成功應用具有重要意義。本研究觀察腺病毒載體對原代培養的大鼠垂體催乳素細胞增殖功能的影響，并進一步探討其可能的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

7周齡雌性Wistar ST大鼠126只，由中國醫科大學實驗動物部提供。腺病毒表達質粒，購自Clontech公司；磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding pro－tein，pCREB）抗體，購自 Cell Signaling公司；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體，購自Oncogene公司。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒載體制備：腺病毒載體（Ad-prl/βgal、Ad-CMV/empty、Ad-CRE/Luc）的制備參照Adeno-X表達系統說明書（Clontech Laboratories，Mountain View，USA）和參考文獻［5］完成。

1.2.2 垂體前葉細胞的培養及分組：Wistar ST大鼠用乙醚麻醉后斷頭，無菌條件下開顱取出垂體，去除后葉。將垂體前葉置于S-MBH的培養皿中，用眼科剪把前葉組織切成細小的碎片，用0.1%的胰蛋白酶消化，37℃振蕩水浴40 min，用吸管吹打細胞后終止消化，細胞懸液經1 100 r/min離心10 min，棄掉上清，滴加DMEM/F12培養液，使垂體前葉細胞再懸浮分散。鏡檢計數后，將100 μl的2×106/ml細胞懸液滴于多聚賴氨酸處理的35 mm培養皿中，以垂體前葉細胞培養皿為觀察單位，隨機分為對照組（細胞未轉染腺病毒載體）、Ad-βgal轉染組和Ad-empty轉染組（未攜帶外源性基因的空腺病毒載體，腺病毒載體劑量為5 MOI）3組，每組8個皿。腺病毒載體轉染組先加入合適劑量的腺病毒載體于細胞懸液中混勻后，再滴入培養皿中，而后置于37℃、5%CO2孵箱中進行培養。

1.2.3 X-gal組化方法鑒定腺病毒載體轉染的效果：腺病毒載體感染垂體細胞72 h，3%多聚甲醛固定10 min，PBS洗5 min，含1%Tween20的TBS孵育30 min，加入 X-gal染色液（1 mg/ml X-gal、5 mmol/L鐵氰酸三鉀、5 mmol/L鐵氰酸四鉀、2 mmol/L氯化鎂溶于PBS），37℃孵育1 h，封片。計數腺病毒感染的藍染陽性細胞率。

1.2.4 5-溴-2′-脫氧尿苷（5-Bromo-2′-deoxyuridine，BrdU）標記法檢測轉染腺病毒載體后的大鼠垂體催乳素細胞的增殖功能：細胞培養第3天，對照組、Adβgal轉染組和Ad-empty轉染組均給予200 μmol/L BrdU，培養3 h，終止培養，收集細胞，用冰甲醇固定，然后用BrdU抗體和催乳素（prolactin，PRL）抗體做雙重免疫細胞熒光染色［6］，封片后用熒光顯微鏡觀察并照相，每個玻片隨機選擇1 000個PRL免疫陽性細胞，計算BrdU標記指數，即PRL和BrdU均陽性的細胞占PRL陽性細胞的百分比。BrdU標記的陽性細胞呈紅色熒光，定位于胞核。所用抗體如下：兔抗大鼠 PRL一抗（NIDDK IC-5，1∶4 000）/FITC標記的抗兔IgG（Amersham公司，1∶50）；小鼠多克隆抗 BrdU（Sigma 公司，1∶200）/生物素化抗小鼠IgG（Vector公司，1∶50）/Texas Red抗鏈霉素蛋白（Amersham 公司，1∶50）。

1.2.5 免疫熒光方法檢測轉染腺病毒載體的催乳素細胞中pCREB蛋白的表達：催乳素細胞分為未轉染腺病毒載體（vehicle）組、胰島素樣生長因子1（insulinlike growth factor-1，IGF-1）組、Ad-empty 轉染組、Adempty+IGF-1 組、Ad-βgal轉染組和 Ad-βgal+IGF-1組。IGF-1處理組為細胞培養第3天加入30 ng/ml IGF-1培養3 h，然后用2%多聚甲醛固定細胞，含1%Tween20的TBS孵育細胞30 min后，3%H2O2孵育細胞10 min，封閉緩沖液封閉30 min后，用pCREB（Ser133）抗體和PRL抗體做雙重免疫細胞熒光染色［7］，用Photoshop軟件定量分析胞核內FITC的熒光強度，計算各組PRL免疫陽性細胞中pCREB蛋白陽性表達率。所用抗體如下：單克隆兔抗 pCREB 一抗（1∶100），FITC 標記的抗兔IgG（1∶100），辣根過氧化物酶標記的抗FITC抗體（1∶200），Tyramide-FITC（1∶50），小鼠抗 PRL 抗體（1∶30 000），Alexa Fluor 594 標記抗小鼠 IgG（1∶100）。1.2.6 熒光素酶報告基因方法檢測轉染腺病毒載體的催乳素細胞中cAMP反應元件（cAMP response element，CRE）基因的表達：每組在制備細胞懸液時，分別加入0.5 MOI的Ad-CRE/Luc。垂體細胞培養第3 天，用 400 μl裂解液（Promega）裂解細胞，收集細胞，4℃、15 000 r/min離心2 min，采用熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組中CRE元件熒光的表達水平，應用分光光度計檢測各組細胞的熒光強度，以每組熒光強度倍數來反映各組細胞中CRE的熒光表達活性。

1.2.7 Western blot方法檢測腺病毒載體對垂體前葉細胞中PCNA表達的影響：各組分別接種濃度為3.0×106/ml的大鼠垂體前葉細胞懸液300 μl于35 mm的培養皿中，培養3 d后，棄去培養液，PBS沖洗，加入100 μl裂解液，15 min后收集細胞，4℃、14 000 r/min離心15 min，取上清液采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。取各組的等量蛋白在12.5%SDS-PAGE中電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h后，在1∶1 000稀釋的單克隆小鼠抗PCNA抗體中4℃孵育過夜，經TBS充分洗膜后，室溫下與1∶8 000稀釋的二抗結合 1 h，ECL 法顯色。以 β-actin（1∶10 000）為內對照，所得圖像用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描，通過Fluor Chen 2.0軟件進行定量分析，測得整合光密度值（integrated density value，IDV）。

1.3 統計學分析

數據用x±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腺病毒載體轉染垂體前葉細胞效率的鑒定

X-gal染色結果顯示，Ad-βgal轉染組垂體前葉細胞藍染，經KS400圖像分析系統計算，報告基因βgal經腺病毒轉移到垂體前葉細胞中的轉染效率為（55.9±2.3）%。見圖 1。

2.2 轉染腺病毒載體對催乳素細胞增殖功能的影響

BrdU和PRL雙重免疫熒光結果顯示，催乳素細胞陽性細胞呈綠色熒光，定位于胞質；胞質呈綠色、胞核呈紅色的細胞為BrdU標記陽性的催乳素細胞，垂體前葉細胞轉染Ad-empty或Ad-βgal后顯著增加催乳素細胞的基礎增殖（P<0.01）。見圖2。

2.3 轉染腺病毒載體對催乳素細胞CRE元件表達的影響

CREB蛋白可與CRE元件特異性結合，發揮重要的核轉錄因子的作用。熒光素酶報告基因結果顯示，轉染Ad-empty或Ad-βgal的垂體細胞CRE元件的表達活性顯著增高（P<0.01）。見圖3。

2.4 轉染腺病毒載體對催乳素細胞pCREB蛋白表達的影響

pCREB和PRL雙重免疫熒光結果顯示，催乳素細胞胞質呈紅色熒光染色，pCREB陽性表達定位于細胞核，呈綠色熒光染色。胞質呈紅色、胞核呈綠色的細胞為pCREB表達免疫陽性的催乳素細胞。與 IGF-1組相比，Ad-empty+IGF-1組和 Ad-βgal+IGF-1組催乳素細胞pCREB的表達活性顯著增加（P<0.01）。Ad-empty 轉染組和 Ad-βgal轉染組pCREB的表達顯著高于未轉染腺病毒載體組（P<0.01）。見圖 4。

2.5 轉染腺病毒載體對垂體前葉細胞PCNA表達的影響

PCNA是一種相對分子量為36 kDa的細胞周期調控蛋白，Western blot結果發現與對照組相比，Ad-empty轉染組和Ad-βgal轉染組垂體細胞內PCNA蛋白的表達顯著增強，其條帶IDV值顯著高于對照組（P<0.01）。見圖5。

3 討論

在基因治療和免疫療法中，腺病毒載體由于其轉基因效率高，且容易獲得高滴度和純度的載體，愈來愈受到研究者們的重視。催乳素增高的垂體瘤是內分泌系統的常見疾病，深入研究導致催乳素細胞異常增殖的影響因素對于探究垂體瘤的病因及發病機制具有重要意義。本研究以原代培養的大鼠垂體前葉細胞為模型，深入探討了腺病毒載體對催乳素細胞增殖功能的影響及可能的細胞內信號轉導機制。本研究發現，表達βgal基因的腺病毒載體及未攜帶外源性基因的空腺病毒載體均明顯增強催乳素細胞的基礎增殖，提示腺病毒載體本身即可改變催乳素細胞的增殖功能，而且垂體前葉細胞在感染以上2種腺病毒載體后，細胞內CRE的活性及pCREB蛋白、PCNA蛋白的表達較對照組亦明顯增高。

CRE元件是一段約30 bp構成的DNA片段，這段序列主要存在于許多靶基因的啟動子與增強子上，而CREB作為一種重要的轉錄因子，被磷酸化激活以后可選擇性結合CRE，刺激相關基因的轉錄。CREB可被諸多蛋白激酶介導的信號轉導途徑激活，其作用非常廣泛，如促進細胞增殖、分化、存活，促進學習記憶等［8，9］。有實驗證明，CREB 磷酸化以后在維持原代培養的催乳素細胞增殖功能中起重要的調節作用，下調CREB基因表達或抑制CRE轉錄活性可降低催乳素細胞的基礎增殖［7］。本研究采用熒光素酶報告基因和定量雙重免疫熒光方法發現垂體前葉細胞轉染重組腺病毒載體后，可顯著增強CRE的活性和pCREB的表達，因此我們推測CREB可能參與了腺病毒載體對催乳素細胞增殖功能的改變。

CREB調節的下游靶基因中包括許多與細胞增殖相關的基因如 c-fos、cyclins A、cyclins D、PCNA等，CREB被激活后可能通過上調這些基因的表達來刺激細胞的增殖［7，10，11］。PCNA 是一種細胞核內合成的分子量為36 kDa的蛋白質，其功能與DNA合成密切相關。檢測細胞中PCNA的表達水平可較好地反映細胞增殖狀態，尤其是對研究某些腫瘤的發生、發展及預后有一定價值。有學者發現PCNA可反映垂體腺瘤細胞的增殖活性。在本研究的Western blot結果中，垂體前葉轉染腺病毒載體后，細胞內PCNA的表達亦顯著增強，與pCREB的表達變化一致。在本研究中PCNA的表達增加是否是因為pCREB上調所致尚需進一步證明。

綜上所述，本研究表明雖然重組腺病毒載體可以被有效地應用于垂體細胞的基因轉染中，但本身也會通過上調pCREB、PCNA蛋白的表達，在一定程度上改變催乳素細胞的增殖狀態，這一結果為闡明腺病毒載體和內分泌細胞之間的相互作用及指導腺病毒載體的成功應用提供了實驗依據。

［1］Castro MG，Goya RG，Sosa YE，et al.Expression of transgenes in normal and neoplastic anterior pituitary cells using recombinant adenoviruses：long term expression，cell cycle dependency，and effects on hormone secretion［J］.Endocrinology，1997，138（5）：2184-2194.

［2］Alesci S，Ramsey WJ，Bornstein SR，et al.Adenoviral vectors can impair adrenocortical steroidogenesis：clinical implications for natural infectionsandgenetherapy［J］.ProcNatlAcadSciUSA，2002，99（11）：7484-7489.

［3］Smith-Arica JR，Williams JC，Stone D，et al.Switching on and off transgene expression within lactotrophic cells in the anterior pituitary gland in vivo［J］.Endocrinology，2001，42（6）：2521-2532.

［4］Lee EJ，Rachel W，Kotlar T，et al.Restoration of growth hormonereleasing hormone（GHRH）responsiveness in pituitary GH3 cells by adenovirus-directed expression of the human GHRH receptor［J］.Endocrinology，2001，142（1）：414-420.

［5］Ishida M，Takahashi W，Itoh S，et al.Estrogen actions on lactotroph proliferation are independent of a paracrine interaction with other pituitarycelltypes：astudyusinglactotrophenrichedcells［J］.Endocrinology，2007，148（7）：3131-3139.

［6］Kawashima K，Yamakawa K，Takahashi W，et al.The estrogenoccupied estrogen receptor functions as a negative regulator to inhibit cell proliferation induced by insulin/IGF-1：a cell context-specific antimitogenic action of estradiol on rat lactotrophs in culture［J］.Endocrinology，2002，143（7）：2750-2758.

［7］Ishida M，Mitsui T，Yamakawa K，et al.Involvement of cyclic adenosine 3'，5'-monophosphate response element-binding protein in the regulation of cell proliferation and the prolactin promoter of lactotrophs in primary culture［J］.Am J Physiol，2007，293（6）：E1529-E1537.

［8］Grady GC，Mason SM，Stephen J，et al.Cyclic adenosine 5'-monophosphate response element binding protein plays a central role in mediating proliferation and differentiation downstream of the pre-TCR complex in developing thymocytes［J］.J Immunol，2004，173（3）：1802-1810.

［9］Tokunou T，Ichiki T，Takeda K，et al.cAMP response elementbinding protein mediates thrombin-induced proliferation of vascular smoothmusclecells［J］.ArteriosclerThrombVascBiol，2001，21（11）：1764-1769.

［10］Mayr B，Montminy M.Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependentfactorCREB［J］.NatRevMolCellBiol，2001，2（8）：599-609.

［11］Dworkin S，Mantamadiotis T.Targeting CREB signalling in neurogenesis［J］.Expert Opin Ther Targets，2010，14（8）：869-879.