Labrasol對葛根素角膜透過性的研究*

舒樂新，趙啟鐸，劉志東，李 琳，宋西衛，李 楠

（1.天津中醫藥大學現代中藥發現與制劑技術教育部工程研究中心研究生，天津 300193；2.天津中醫藥大學，天津 300193）

角膜上皮是藥物眼部吸收的主要屏障，角膜上皮的滲透性較差。常規滴眼劑存在滯留時間短、生物利用度低（僅為1%～10%）、患者順應性差等問題。應用滲透促進劑能夠改善角膜的透過性，增加藥物的跨膜吸收[1]。

葛根素（PUE）是一種異黃酮類化合物，可從豆科植物野葛[Puerarialobata（Willd.）Ohwi]的干燥根中提取得到。葛根素具有β受體阻滯作用和改善微循環作用,近年來在青光眼的治療中得到了廣泛地應用。辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）是一種新型的吸收促進劑，被廣泛用于口服和經皮給藥系統[2]。

實驗主要考察將Labrasol作為滲透促進劑應用于眼用制劑，前期實驗考察了Labrasol在質量濃度為0.5%～3%內沒有刺激性[3]。采用離體角膜透過技術，研究其對葛根素的角膜透過率的影響，并對Labrasol的作用機制進行探討，從而明確Labrasol作為一種新型的吸收促進劑是否有好的眼用促滲作用，為以后的眼用促滲劑提供基礎。

1 儀器與試藥

TK－20A型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司），改良的Franz擴散池（上海鍇凱科技貿易有限公司），Milli－Q 超純水系統（Millipore，美國），AX205電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士），高效液相色（HPLC）譜儀（島津，SPD－10AvpUV－VIS DETECTOR，LC －10ATvp，LIQUID CHROMATOGRAPH，日本）。葛根素對照品（天津馬克生物技術有限公司純度99%），葛根素原料藥（純度>90%，西安賽幫醫藥有限公司），Labrasol（Gattefosse，法國），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 擴散介質 以谷胱甘肽一碳酸氫鈉林格溶液(GBR)為擴散介質。文獻[4]報道，該生理溶液可保存離體角膜達6 h。它由2部分溶液組成,一部分含氯化鈉12.400 g/L、氯化鉀0.716 g/L、磷酸二氫鈉0.206 g/L、碳酸氫鈉4.908 g/L;另一部分含氯化鈣0.230 g/L、氯化鎂 0.318 g/L、葡萄糖 1.800 g/L、谷胱甘肽（氧化型）0.184 g/L。上述2溶液低溫儲存，用前等量混合。

2.2 Labrasol對葛根素角膜透過率的影響 將家兔耳緣靜脈注射空氣致死。在死后20 min內用眼科手術剪和鑷子小心分離出角膜，除去鞏膜、虹膜、睫狀體等多余組織。將新鮮離體角膜小心固定在Franz擴散池的供給池和接受池之間，使上皮層面向供給池，在接受池中加入新鮮配制的GBR溶液4.5 mL，在供給池中加入含0.2%藥物的不同濃度的Labrasol溶液0.5 mL。裝置置于透皮擴散實驗儀中，溫度控制在（37±1）℃。實驗開始后，分別在 40、80、120、160、200、240 min從接受池中取樣4.5 mL，同時補充等體積同溫的GBR溶液，樣品經0.45 μm微孔濾膜過濾后，用HPLC測定。

2.3 數據處理 單位面積累積透過量Q可由下式求算：

其中Cn為時間藥物的測定濃度，Ci為時間前的測定濃度，V0為接受池中溶液體積，V為取樣體積。表觀滲透系數（Papp,cm/s）定義為：其中C0為供給池初始藥物濃度；A為有效透過面積；△Q/△t可由累積透過量—時間曲線穩態部分的斜率求得。

表觀滲透系數以兩獨立樣本t檢驗進行統計學分析。

2.4 角膜水化值的測定 將體外實驗后暴露于擴散介質的角膜區域稱其質量,記為m；60℃干燥15 h后再次稱其質量，記為ma。角膜水化值按下式計算：

2.5 樣品的測定

2.5.1 色譜條件 HPLC法測定樣品中葛根素含量。色譜柱：Diamond DIKMA ODS－C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇：1%（質量分數）檸檬酸溶液（體積比 35∶65），流速:1 mL/min，檢測波長：250 nm，進樣量：20 μL，柱溫：30 ℃，色譜圖見圖1。

2.5.2 專屬性考察 取不加藥物的空白角膜內容物GBR溶液20 μL，注入高效液相中，色譜圖見圖2。

如圖可見空白角膜內容物對葛根素無干擾。

2.5.3 方法學考察 精密配制一系列質量濃度分別為0.016～0.8 mg/L和0.8～16 mg/L的葛根素GBR溶液，進樣20 μL，記錄峰面積。樣品質量濃度與峰面積的標準回歸方程分別為 A＝1.1061×104C＋552.33（r＝0.9999）和 A＝1.16259×105C－ 2.0998×103（r＝0.9999）。由相關系數可知樣品質量濃度與峰面積線性關系良好。分別在2個范圍內配低、中、高3個質量濃度的葛根素GBR溶液0.032、0.128、0.560mg/L和1.6、8.0、16.0 mg/L。測得日內精密度峰面積的相對標準偏差分別為2.0%、1.2%、0.1%和0.5%、0.7%、0.5%。日間精密度RSD分別為1.2%、0.9%、0.6%和0.4%、1.0%、0.7%，說明儀器精密度良好。

3 結果

3.1 Labrasol對葛根素角膜透過性的影響 本實驗以0.2%的葛根素GBR液為對照，分別考察了0.5%、1%、1.5%、2%、3%的 Labrasol為促滲劑時葛根素的角膜透過性。葛根素離體角膜透過參數見表1，透過曲線方程圖見圖3。

如圖3，葛根素的表觀滲透系數隨著Labrasol濃度的升高而增大，Labrasol濃度為 0.5%、1%、1.5%、2%、3%時，葛根素的表觀滲透系數分別是對照組的 1.87倍、4.41倍、7.42倍、8.02倍、9.60倍，與對照組比都有顯著性差異。

3.2 Labrasol對角膜水化值的影響 角膜水化值是體外評價物質對該組織刺激性的重要指標，以此來考察促滲劑對角膜的損傷，正常的角膜水化值為76%～80%，超過83%，即可判定角膜受到一定程度的損傷[5]。實驗中葛根素不同濃度的Labrasol對角膜水化值沒有顯著影響，表明實驗過程中沒有對角膜上皮細胞和內皮細胞造成損傷，見表1。

表1 Labrasol對葛根素離體角膜透過參數影響(±s，n=3)Tab.1 The Effect of Labrasol on the transcorneal permeability coefficient of PUE(±s，n=3)

表1 Labrasol對葛根素離體角膜透過參數影響(±s，n=3)Tab.1 The Effect of Labrasol on the transcorneal permeability coefficient of PUE(±s，n=3)

注：與對照組比較，*P<0.01。

r2組別對照0.5%Labrasol 1%Labrasol 1.5%Labrasol 2%Labrasol 3%Labrasol線性方程Q=0.011 4t－0.="tb Q=0.021 3t－0.21 t Q=0.050 0t－2.50 t Q=0.077 3t－2.77 t Q=0.090 8t－2.90 t Q=0.109 0t－3.09 t 0.99320.99190.98600.99490.99430.9956 Papp×106（cm/s）1.86±0.273.47±0.45*8.21±1.67*13.8±1.93*14.92±1.88*17.85±1.76*角膜水化值/%77.07±1.0880.03±0.6579.46±1.6179.48±1.2181.67±1.1482.17±0.60

4 討論

實驗考察了0.5%～3%的Labrasol對葛根素的角膜透過性，結果葛根素的表觀滲透系數隨著Labra sol濃度的增加而增大，是對照組的1.87倍到9.60倍，與空白比都有顯著性差異（P＜0.01），表明Labrasol對葛根素有很好的促滲作用。

Labrasol增加藥物角膜滲透性的機制主要有兩種。第1種，通過破壞角膜細胞膜，或者通過滲透進入細胞膜，或者通過從細胞膜提取脂溶性的物質如膽固醇和磷脂來增加藥物的角膜透過量。第2種，作為藥物載體，通過保持藥物在溶液中的親水性，經過黏蛋白層將藥物傳遞到角膜表面，然后以擴散的方式透過角膜進入眼組織。

由實驗結果可知,葛根素的表觀滲透系數隨著Labrasol濃度的升高而增大，當Labrasol的濃度為1.5%時達到一個平臺區，統計學比較組間差異1.5%、2%與 3%，這 3組間沒有差異（P＞0.05），表明在統計意義上沒有增大，達到了平衡。因此，Labrasol的作用機制可能是兩種作用機制共同作用的結果。當Labrasol的濃度較低時，葛根素的表觀滲透系數隨Labrasol濃度的增加而增加，第1種作用機制可能起主要作用。當Labrasol的濃度較高時，第2種作用機制可能起主要作用。當存在過量的Labrasol時，葛根素的表觀滲透系數隨Labrasol濃度的增加而不再增加，達到平衡。

由此表明一定濃度的Labrasol可顯著提高葛根素的角膜透過率，且對角膜無刺激性，因此在實踐中可被廣泛應用。

[1]ASHIM K.Ophthalmic Drug Delevery Systems[M].2nd Missouri,USA:Marcel Dekker,Inc,2000:218-220.

[2]Sateesh K,Ramesh P.Nanoemulsions as Versatile Formulations for Paclitaxel Delivery:Peroral and Dermal Delivery Studies in Rats[J].J Invest Dermatol,2007,127(1):154-159.

[3]張欣華,劉志東,張伯禮,等.Labrasol對兔眼刺激性評價[J].醫藥導報,2009,28(7):838-840.

[4]ROJANESEKUL Y,ROBINSON JR.Transport mechanisms of the cornea.Characterizatim of barrier permselectivity[J].Int J Pharm,1989,55(2-3):237-239.

[5]Saettone MF,Chetom P,Cerbai R,etal.Evaluation of ocular permeation enhancers in vitor effects on corneal transport of four blockers，and in ivtro/in vivo toxic activity[J].Int J Pharm,1996,142:103-109.