止喘湯對哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的影響*

張占鋒，霍博雅

（1.河南省鄢陵縣人民醫(yī)院內(nèi)科，鄢陵 461200；2.遼寧醫(yī)學(xué)院第三醫(yī)院中醫(yī)科，錦州 121001）

哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病，其發(fā)病率、病死率均呈逐年上升的趨勢。哮喘反復(fù)發(fā)作可引起氣道重塑，導(dǎo)致不可逆性氣流阻塞及持續(xù)性氣道高反應(yīng)性，只有控制或者逆轉(zhuǎn)了氣道重塑，哮喘才可能得到真正意義上的控制。中醫(yī)治療哮喘有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)通過對致敏大鼠反復(fù)霧化吸入抗原建立慢性哮喘模型，觀察中藥復(fù)方早期干預(yù)對哮喘大鼠氣道炎癥和重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型制備 8周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g（遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供），隨機(jī)分成4組隨機(jī)分為4組：正常組、哮喘組、布地奈德（BUD）組和止喘湯組，每組10只。參照Holgate等[1]的方法復(fù)制大鼠慢性哮喘模型。第1、8天腹腔注射10%的卵蛋白（OVA）（GradeⅢOVA，SigmaA5378）混懸液1mL（內(nèi)含OVA 100 mg、氫氧化鋁100 mg）致敏，自15 d始分別將各組大鼠鼠置于30 cm×30 cm×40 cm有進(jìn)出兩口的有機(jī)玻璃箱內(nèi)，以1%OVA溶液霧化吸入，0.5 mL/min，30 min/次，1次/d，共6周。止喘湯組：每次激發(fā)前30 min中藥灌胃（取生藥500 g，分別加8倍量的水，分別提取2次，每次1 h，過濾，常壓濃縮至500mL，由遼寧醫(yī)學(xué)院第三醫(yī)院中藥制劑室提供），按大鼠體質(zhì)量（10 mL/kg）給予。BUD組：激發(fā)前30 min生理鹽水灌胃及5 mL∶1 mg BUD（阿斯利康制藥有限公司，批號國藥準(zhǔn)字 H20030410，規(guī)格 5 mL∶20 mg）霧化吸入。哮喘組生理鹽水灌胃；正常組腹腔注射、灌胃及霧化吸入分別以生理鹽水代替。以大鼠呼吸急促、口唇發(fā)紺、點(diǎn)頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為模型建立成功的標(biāo)志。

1.2 標(biāo)本采集 各組大鼠均于末次激發(fā)24 h內(nèi)取材。20%烏拉坦5 mL/kg腹腔麻醉，剪開頸部皮膚，鈍性分離頸動脈，取血2 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，采用常規(guī)計(jì)數(shù)法測定白細(xì)胞總數(shù)及其分類。打開胸腔，結(jié)扎右主支氣管，分離出頸部氣管，參考文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行左側(cè)支氣管肺泡灌洗，將收集的支氣管肺泡灌洗液（BAL）盛入15 mL塑料離心管（置于冰浴中），重復(fù)上述操作4次，收集全部 BAL（回收率＞85%）計(jì)量后取少量在改良的Neubauer計(jì)數(shù)臺上計(jì)數(shù)BAL中白細(xì)胞總數(shù)，余下的BAL 4℃離心（1500 r/min）10 min，取細(xì)胞沉淀涂片、瑞氏染色后在油鏡下作白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。放血后取右肺中葉肺組織置于4%的多聚甲醛中抽氣固定48 h后，進(jìn)行脫水，透明，垂直于氣道取材，石蠟包埋，切片，片厚4 μm，切片按HE常規(guī)染色步驟染色。

1.3 氣道炎癥和氣道壁厚度測定 蘇木精-伊紅（HE）染色后，每組隨機(jī)抽取10張切片，400倍光鏡下選擇內(nèi)徑100～200 μm的細(xì)支氣管區(qū)，采集5處視野，計(jì)數(shù)單位氣道面積（2200 μm2）的炎性細(xì)胞數(shù)，以評估氣道炎癥[3]；每張切片選取3支內(nèi)周長（支氣管基底膜周徑）為1000～3000 μm的膜性大、中級小支氣管，在100倍光鏡下參照文獻(xiàn)[4]用病理圖像分析系統(tǒng)，測定支氣管基底膜周徑（Pbm）、總管壁面積（Wat）、平滑肌面積（Wam），并用Pbm將測量值標(biāo)準(zhǔn)化，分別以Wat/Pbm、Wam/Pbm表示，代表相應(yīng)管壁層的厚度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血、BAL中嗜酸性細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化情況 哮喘組與正常組比較外周血、BAL中嗜酸粒細(xì)胞（EOS）明顯升高（P＜0.01）；應(yīng)用藥物干預(yù)后，治療組與哮喘組相比較，上述指標(biāo)明顯下降（P＜0.01）；止喘湯與BUD組比較上述指標(biāo)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果見表1－表2。

表1 各組間外周血白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的比較（±s）Tab.1 Comparison of total and differential counts of Leukocyte in PB in different groups（±s）×109個(gè)/L

表1 各組間外周血白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的比較（±s）Tab.1 Comparison of total and differential counts of Leukocyte in PB in different groups（±s）×109個(gè)/L

注：與正常組比較▲P<0.01，與哮喘組比較★P<0.01，與BUD組比較▼P>0.05。

組別正常組哮喘組BUD組止喘湯組n 10101010細(xì)胞總數(shù)9.9321±1.489240.1859±5.1696▲22.7128±3.3706★24.1346±1.9981★嗜酸粒細(xì)胞0.3839±0.09160.1565±0.0179▲0.0777±0.0209★0.0805±0.0155★淋巴細(xì)胞6.7447±0.989114.4961±1.8684▲9.6860±1.7925★10.0282±2.3649★

表2 各組間BAL白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的比較Tab.2 Comparison of total and differential counts Leukocyte of BAL in different groups（±s）×109個(gè)/L

表2 各組間BAL白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的比較Tab.2 Comparison of total and differential counts Leukocyte of BAL in different groups（±s）×109個(gè)/L

注：與正常組比較▲P<0.01，與哮喘組比較★P<0.01，與BUD組比較▼P>0.05。

組別正常組哮喘組BUD組止喘湯組n 10101010細(xì)胞總數(shù)3.6521±0.335910.5212±1.0067▲6.3331±0.7999★6.9139±0.4488★嗜酸粒細(xì)胞0.0133±0.00210.0379±0.0039▲0.0243±0.0025★0.0261±0.0028★淋巴細(xì)胞0.7481±0.06953.2847±0.3895▲1.8291±0.1799★1.9740±0.1604★

2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察 HE染色顯示，正常組支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)正常，各級支氣管上皮完整，肺泡間隔正常，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；哮喘組支氣管黏膜上皮大片壞死和脫落，管壁以嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤明顯，肺泡間隔、平滑肌和基底膜增厚；治療組支氣管黏膜上皮部分脫落，少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔、平滑肌和基底膜較空白對照組略有增厚。見圖1。

2.3 氣道炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果單位氣道面積內(nèi)，哮喘組和治療組炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)高于正常組，哮喘組高于治療組（均P＜0.01）。但治療組間炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。形態(tài)學(xué)指標(biāo)顯示，哮喘組較對照組和治療組氣道壁厚度明顯增加（均 P＜0.01），BUD 組與止喘湯組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 氣道炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果（±s）Tab.3 Counts of airway inflammatory cell and Morphological Indexes in different groups（±s）

表3 氣道炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果（±s）Tab.3 Counts of airway inflammatory cell and Morphological Indexes in different groups（±s）

注：與正常組比較▲P<0.01，與哮喘組比較★P<0.01，與BUD組比較◆P>0.05；各組間比較▼P>0.05。

Pbm（Hm）組別Wat/Pbm正常組哮喘組BUD組止喘湯組炎性細(xì)胞（Wat）（個(gè)/2,200 μm2）11.65±1.2929.52±4.54▲16.81±3.37★18.43±2.00★◆1677.92±178.111663.93±292.021680.48±202.361728.67±239.5352.26±5.9477.92±9.47▲63.20±4.74★64.44±6.78★◆Wam/Pbm（μm2/μm）12.74±2.1429.96±4.50▲22.60±2.37★23.34±2.76★◆

3 討論

病理學(xué)研究表明，哮喘的病理改變涉及整個(gè)支氣管樹，炎性細(xì)胞浸潤不僅累及氣道壁，也出現(xiàn)于外周肺組織。Th2反應(yīng)介導(dǎo)的嗜酸粒細(xì)胞浸潤已被認(rèn)為是哮喘氣道炎癥的一個(gè)顯著特征。氣道重塑是哮喘的重要病理特征之一，成為哮喘近年來研究的熱點(diǎn)之一，但其發(fā)生機(jī)制并未完全闡明?，F(xiàn)被普遍接受的提法是由于急性炎癥反復(fù)發(fā)作而轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y，氣道反復(fù)損傷與修復(fù)，大量炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)浸潤并繼發(fā)氣道重塑[5]。

中醫(yī)認(rèn)為哮喘的病因是先天不足、臟腑失調(diào)，宿痰內(nèi)伏、外邪觸發(fā)，病久瘀血，以虛實(shí)夾雜、本虛標(biāo)實(shí)為特征。止喘湯（黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、桑白皮、杏仁、葶藶子、黃芩、丹參、川芎）是基于哮喘基本病機(jī)證型的復(fù)方，由定喘湯合四君子湯加減而成。全方具有補(bǔ)益肺脾腎、活血化瘀、清泄肺熱、祛痰止咳平喘，為根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的自擬中藥合劑，臨床應(yīng)用效果良好?，F(xiàn)代藥理研究方中的甘草、杏仁、黃芩、丹參、川芎等都有不同的治療哮喘的作用。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠建立慢性哮喘模型，觀察中藥復(fù)方止喘湯對致敏大鼠抗原激發(fā)所產(chǎn)生的氣道炎癥及氣道重塑的影響。結(jié)果表明，致敏大鼠分別經(jīng)過長期反復(fù)抗原激發(fā)，出現(xiàn)了支氣管壁及支氣管肺泡內(nèi)以嗜酸粒細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)，氣道壁本身亦出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)性變化，表現(xiàn)為氣道壁的增厚、支氣管黏膜上皮脫落、上皮下纖維化、平滑肌細(xì)胞的增生肥大等，這些均為氣道重塑的特征性病理改變。筆者發(fā)現(xiàn)止喘湯不僅可以抑制氣道炎癥，降低外周血、BAL中EOS數(shù)量，而且能有效預(yù)防氣道重塑的發(fā)生。提示止喘湯可能通過減少EOS氣道浸潤控制氣道炎癥，減輕和延緩氣道重塑；也可能通過其他途徑如炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子等對氣道炎癥和重塑起作用[6]；還可能本身就有抗氣道重塑的作用；明確機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為止喘湯作為哮喘臨床辨證治療的基礎(chǔ)方提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

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