五田保肝液對酒精性肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達影響的實驗研究*

宋星星 ，蘇金玲 ，畢業東 ，于建江 ，范英昌

（1.天津中醫藥大學病理教研室，天津 300193；2.天津市漢沽區中醫醫院，天津 300480）

近年來，中國飲酒人數增多，尤其是長期、大量飲酒對飲酒者的健康危害巨大，而最嚴重的是發展為酒精性肝纖維化、肝硬化。因此，開發預防、治療酒精性肝纖維化的藥物具有重要的意義。天津市漢沽區中醫醫院經過多年研究，研制的現代中藥制劑“五田保肝液”由田基黃、垂盆草、敗醬草等藥物組成，是針對酒精性肝病（ALD）進行治療的方劑，廣泛用于預防和治療酒精性肝炎、脂肪肝、肝纖維化和肝硬化，具有清熱解毒利濕、活血化瘀的功效，但其發揮作用的分子機制仍不清楚。本實驗通過構建大鼠酒精性肝纖維化模型，并檢測血清Ⅲ型前膠原蛋白肽（PⅢP）、層黏連蛋白（LN）等肝纖維化血清學指標和檢測肝組織轉化生長因子β1（TGF-β1）mRNA的表達，探討五田保肝液對酒精性肝纖維化是否有干預作用以及與TGF-β1的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠100只，雄性，體質量180～220 g，由北京科宇動物養殖中心提供。飼養于天津中醫藥大學實驗動物中心（環境設施符合《中華人民共和國衛生部實驗動物標準》二級標準）。

1.1.2 主要試劑 五田保肝液：由深圳市三九現代中藥有限公司提供（由田基黃、垂盆草、敗醬草、丹參、五味子、山楂、草決明、澤瀉、柴胡、生甘草水煎煮，濃縮、干燥、制成單味中藥配方顆粒，以質量按6∶6∶4∶4∶3∶3∶3∶2∶2∶1 的比例配成水溶液。質量標準《中藥材生產質量管理規范（試行）》（GAP）。易善復(多烯磷脂酰膽堿膠囊)，由北京賽諾菲安萬特制藥有限公司生產。62°牛欄山二鍋頭，由北京順鑫農業股份有限公司生產。吡唑，購自上海晶純試劑有限公司。玉米油，購于中糧食品營銷有限公司。大鼠LN及PⅢP酶聯免疫檢測法（ELISA）試劑盒，購于美國RB公司。丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒，購于中生北控生物科技股份有限公司；SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒，購于大連寶生物。RNA-Solv Reagent試劑盒，購于美國Omega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒精性肝纖維化大鼠模型建立[1]及給藥 100只Wistar雄性大鼠適應性飼養1周，分為正常對照組（N組）10只、模型組（M組）、中藥低劑量組（WⅠ組）、中劑量組（WⅡ組）、高劑量組（WⅢ組）、陽性藥易善復對照組（Y組）各18只。M組、WⅠ組、WⅡ組、WⅢ組、Y組大鼠均以62度牛欄山二鍋頭酒[10mL/（kg·d）]、玉米油[2mL/（kg·d）]、吡唑[25mL/（kg·d）]混合物灌胃，2次/d，早晚各1次。WⅠ組、WⅡ組、WⅢ組大鼠于兩次灌胃之間分別給予五田保肝液0.51 g，1.02 g（成人等劑量），2.04 g/（kg·d）灌胃；Y組和M組大鼠于兩次灌胃之間給予相當于成人等劑量的易善復0.12 g/（kg·d）水溶液和相應劑量的生理鹽水灌胃，N組則每日3次以相應劑量生理鹽水灌胃。各組大鼠實驗期間均予全價營養顆粒飼料喂養，自由進食飲水。造模時間為12周。

1.2.2 標本采集 末次給藥后禁食，隔夜，次日上午處死大鼠，處死前內眥靜脈取血，分離血清為ELISA備用；從每只大鼠肝左葉的相同部位取部分組織用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片后，進行常規蘇木精-伊紅（HE）和Masson染色；另從肝右葉的相同部位取小塊組織迅速存于-70℃冰箱，為實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）備用。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 組織病理學指標檢測 常規HE染色觀察肝臟病理學改變，Masson染色觀察肝纖維化情況。

1.2.3.2 血清學指標檢測 ELISA法檢測PⅢP、LN，均按試劑盒說明書操作。

1.2.3.3 實時定量RT-PCR方法檢測肝組織TGF-β1表達 1）采用RNA－Solv Reagent試劑盒提取肝組織（50－100 μg）總 RNA。2）依試劑盒說明書，采用SYBR Prime ScriptTMRT－PCR Kit試劑盒，以 Random 6 mers和 Oligo Dt Primer為引物將總 RNA（500 ng）反轉錄為 cDNA（10 μL 體系）。3）以 500 ng的 cDNA產物用作定量PCR擴增的模板，采用SYBR Prime－ScriptTMRT-PCR Kit試劑盒和以相應基因的特異性引物進行PCR擴增，看家基因GAPDH為內參，數據采用2-△△CT相對定量法分析。

引物設計：GAPDH的上游引物為5′-CCCCCA ATGTATCCGTTGTG-3′,下游引物為 5′-TAGCCCA GGATGCCCTTTAGT3′；TGF-β1 的上游引物為 5′-CACCATCCATGACATGAACCG-3′，下游引物為 5′-TTGGTATCCAGGGCTCTCCG-3′。

1.2.4 統計方法 用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，所有資料以均數±標準差（±s）表示，比較均采用單因素方差檢驗，以P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 各組大鼠死亡情況 正常組大鼠健康狀況良好，實驗過程中無一只死亡。其他各組大鼠均有死亡，多由乙醇誤入氣管或急慢性乙醇中毒導致。實驗結束后各組剩余大鼠為：正常組10只，模型組8只，五田保肝液低劑量組10只，中劑量組9只，高劑量組10只，陽性藥組9只。

2.2 肝組織病理形態學改變

2.2.1 肝組織HE染色結果HE染色顯示正常組大鼠肝組織形態結構完整，肝細胞排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，無明顯病變。模型組大鼠大量肝細胞內出現脂滴，大量點狀、灶狀壞死伴有炎細胞浸潤，嗜酸性變多見；五田保肝液各治療組與易善復治療組肝組織脂肪變性、壞死、嗜酸性變與模型組比較均有不同程度的減少。

2.2.2 肝組織Masson染色結果正常組大鼠Masson染色顯示僅有少量膠原表達；模型組大鼠可見匯管區和中央靜脈周圍有較多的膠原纖維增生，呈放射狀向外延伸，但未相互連接形成間隔，在肝細胞周圍、肝血竇、狄氏間隙亦有少量膠原表達；五田保肝液各治療組與易善復治療組肝組織膠原表達均有不同程度減少，以五田保肝液中、高劑量組和易善復組明顯，匯管區和中央靜脈周圍纖維化少見。

2.3 大鼠血清PⅢP、LN水平 見表1。

表1 五田保肝液對酒精性肝纖維化大鼠血清LN和PⅢP的影響(±sTab.1 Effect of Wutian Baogan solution on LN and PⅢP in rats with of alcoholic liver fibrosis(±sμg/L

表1 五田保肝液對酒精性肝纖維化大鼠血清LN和PⅢP的影響(±sTab.1 Effect of Wutian Baogan solution on LN and PⅢP in rats with of alcoholic liver fibrosis(±sμg/L

注：與N組比較#P＜0.01；與M組比較*P＜0.01。

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模型組大鼠血清LN和PⅢP水平較正常組顯著升高（P<0.01），其他各組大鼠血清LN和PⅢP水平較之模型組降低明顯（P<0.01）。

2.4 大鼠肝組織TGF-β1的表達 見表2。

表2 五田保肝液對酒精性肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 mRNA表達的影響Tab.2 Effect of Wutian Baogan solution on TGF-β1mRNA expression in rats with alcoholic liver fibrosis

結果表明：模型組及各治療組TGF-β1的mRNA表達均高于正常組，差異有顯著性（P＜0.01）；模型組TGF-β1的mRNA表達高于五田保肝液各劑量組和易善復組，差異有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

中醫古代文獻對過度飲酒而引起的一系列病證有全面的認識，其中《諸病源候論》所述“酒癖”與酒精性肝纖維化相符，認為是過度飲酒，酒、飲停滯于脅肋下，結聚成癖[2]，因此，在酒精性肝纖維化的治療上不但要清熱利濕解毒，更要注重解散瘀結。本實驗所用五田保肝液中田基黃清熱利濕，解毒、散瘀、消腫、止痛，垂盆草清熱解毒、利尿消腫共為君藥，以解濕熱酒毒。敗醬草清熱解毒，排膿破瘀、丹參活血祛瘀共為臣藥，助君藥清熱利濕，并能活血化瘀。酸入肝，五味子、山楂味酸能收斂肝陰，山楂亦能活血化瘀，草決明清肝熱、利水，澤瀉利水滲濕、泄熱，共為佐藥。柴胡主入肝經，引諸藥入肝經，為引經藥。《金匱要略》曰：“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾。”甘草味甘補脾、又能解毒，調和諸藥，與柴胡共為使藥。總之，五田保肝液作為一種新型的保肝中藥制劑是否具有抗酒精性肝纖維化作用及其作用效果的可能機制是否與TGF-β1有關是本實驗研究的目的。

目前肝纖維化具體機制還不明確，一般認為其發生主要是某些細胞因子使肝星形細胞激活，導致包括膠原、非膠原性糖蛋白、蛋白多糖在內的肝細胞外基質（ECM）合成增多、降解不足，過多的沉積于肝內所致[3]。本實驗通過對標志性的肝纖維化血清學指標PⅢP、LN的聯合檢測從而更全面的反映肝纖維化程度[4]。實驗數據顯示，五田保肝液各治療組與模型組比較血清PⅢP、LN水平降低明顯（P<0.01），大鼠肝組織HE與Masson染色結果也表明五田保肝液各治療組在肝組織病變程度與膠原表達方面較模型組有明顯減輕，這說明五田保肝液能夠有效抑制酒精性肝纖維化的發展，提示其有良好的保肝作用。

轉化生長因子β1（TGF-β1）與肝纖維化密切相關，是促進肝纖維化的重要生長因子，在纖維化的發生、發展過程中起關鍵作用[5]，在本實驗中，五田保肝液各治療組與模型組比較肝組織TGF-β1mRNA表達明顯降低（P<0.01），說明五田保肝液在降低血清PⅢP、LN水平的同時降低了TGF-β1mRNA表達，提示五田保肝液可能通過降低肝組織TGF-β1來起到抗纖維化作用。

本實驗還發現，中等劑量的五田保肝液降低血清PⅢP、LN水平及TGF-β1mRNA表達效果最好，而高劑量的五田保肝液卻略有降低，這說明中等劑量的五田保肝液保肝效果最好，可能原因是五田保肝液的作用效果在中等劑量時達到峰值，其具體機制還須進一步研究。

[1]丁 霞,蒙一純,賁長恩,等.酒精性肝纖維化動物模型的建立[J].中國中醫基礎醫學雜志,1999,5(7)：18-20.

[2]丁 霞,楊晉翔,王 婧,等.酒精性肝纖維化中醫證素分析[J].中國中醫基礎醫學雜志,2009,15(2):136-137.

[3]丁 寧.肝纖維化形成機制的研究進展[J].臨床肝膽病雜志,2009,25(1):73-77.

[4]張 萍,李曉斐,劉慶麗.檢測血清中LN、CIV、PⅢP、HA的含量對肝纖維化及肝硬化的診斷價值[J].醫藥世界,2007,9(1):46-47.

[5]李雪萍,王煥英.轉化生長因子β1與肝纖維化關系[J].中國實用醫藥,2009,33(4):227-228.