二球懸鈴木葉片離體植株再生

李思，金亮，陳永勤，楊之帆

(湖北大學 生命科學學院，湖北 武漢 430062)

懸鈴木為懸鈴木科、懸鈴木屬植物的統稱.該屬植物大約有10種，原產東南歐及美洲等國家[1].其中，一球懸鈴木、二球懸鈴木和三球懸鈴木生長速度快、主干高大、分枝能力強、樹冠廣闊，夏季具有很好的遮蔭降溫效果，并有滯積灰塵、吸收硫化氫、二氧化硫、氯氣等有毒氣體的作用，同時具有適應性廣、生長快、繁殖與栽培比較容易等優點，已作為園林植物廣植于世界各地，被稱為“行道樹之王”.我國引入了這3種懸鈴木，并被全國綠化委員會選定為優良骨干園林樹種，在全國城鄉廣為栽培.

但是，一球懸鈴木、二球懸鈴木和三球懸鈴木都有共同的缺陷，即成年植株會大量開花、結果，每年春夏季節形成大量的花粉，同時上年的球果開裂、產生大量的果毛.據統計，一株10生、胸徑為10 cm的懸鈴木，每年可結200～400個球果，而每個球果均可產生200萬～500萬根左右的果毛[2].這些漂浮于空中的花粉和果毛容易進入人們的呼吸道，引起部分人群發生過敏反應，引發鼻炎、咽炎、支氣管炎癥、哮喘病等諸多病癥.

為了解決懸鈴木果毛的問題，目前人們主要采用修剪控果和化學疏花疏果兩種措施.修剪控果就是切鋸能旺盛開花結果的枝條以達到顯著減少懸鈴木的結果量[3-5].該方法工作量大，需要年年操作，而且不能徹底解決果毛的問題；同時，修剪還影響夏季遮蔭效果.化學疏花疏果是利用化學藥劑(如乙烯利、脫落酸、赤霉素、石硫合劑、碘化鉀、三氯醋酸等)在開花期間噴灑或注射于懸鈴木上，促進花和幼果萎縮、脫落，從而達到控制懸鈴木果毛污染的目的[6-8].化學方法也存在工作量大、成本高、除花除果不徹底等問題，并且化學藥劑容易污染環境.

培育無果的品種是解決懸鈴木果毛污染問題最好的方法.雖然人們在這方面做了不少努力，但效果甚微[9].植物分子生物學與基因工程技術的發展為解決懸鈴木的花粉和果毛引起的問題帶來了希望，如雄性不育技術[10]、雌性不育技術[11]和無籽技術[12]均可以防止懸鈴木結果，解決果毛污染的問題.我們還研究出了防止植物開花的基因工程技術(待發表)，該技術的應用有望培育出不開花的懸鈴木，從而可以徹底解決其花粉和果毛所帶來的危害.

眾所周知，建立高效的離體再生體系是進行植物基因工程研究的必要前提.為了利用轉基因技術對其進行遺傳改良，人們對一球懸鈴木、二球懸鈴木和三球懸鈴木的離體再生技術進行研究，發現誘導不定芽的最佳材料為下胚軸[13]和種子苗的真葉[14-16].我們在進行二球懸鈴木轉基因技術研究時，發現其當年成熟的種子不僅消毒困難，而且萌發率低，難以得到足夠的材料進行轉基因研究.為此，我們研究了二球懸鈴木無菌種子苗所繁殖的植株的葉片離體再生的條件，為利用這些植株的葉片培育轉基植株提供參考.

1 材料與方法

1.1材料湖北大學校園內生長健壯的二球懸鈴木(PlatanusacerifoliaWilld)大樹上當年生球果.

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理與消毒 剝離球果中的種子，用自來水沖洗60 min，再用含洗滌液的自來水揉洗10 min，然后用自來水沖洗干凈.用濾紙吸干種子表面的水分后，在75%的酒精中浸泡60 s，然后轉入加有少量tween20 的3%雙氧水中，在搖床(100 r/min)上室溫消毒24 h；經無菌水沖洗3遍后，用無菌濾紙吸干種子表面水分，將種子接入萌發培養基上.

1.2.2 種子無菌萌發和實生苗的繁殖 種子無菌萌發的幼苗伸長后，將其切成小段，每段帶2～3 片葉，接種在增殖培養基上.待莖段形成的新幼莖長出6～8 片葉時，將新幼莖切成小段，每段帶2～3 片葉，接種在增殖培養基上.每25～30 d繼代培養一次.

1.2.3 實生苗葉片不定芽的誘導 將在增殖培養基上繼代6次所形成的植株上的葉片切成小塊(大約0.5 cm × 0.5 cm)、接種到添加有不同種類和不同濃度激素的不定芽誘導培養基上.

為了研究植株繼代次數對葉片形成不定芽的影響，分別將繁殖10代、15代和20代的植株的葉片切成小塊、接種到添加最佳激素組合的不定芽誘導培養基上.

1.2.4 不定芽生根與移栽 將長1.0 cm以上的不定芽切下，接入不同的生根培養基上.當植株長出3～5條根后，打開瓶塞，在培養室煉苗3 d.然后將植株取出，用自來水清洗后，栽入由泥碳土、河沙和土壤配置的基質中，澆透水，保持80%左右的相對濕度、適當遮蔭.

1.3培養基與培養條件本試驗所用的基本培養基含大量元素500 mg/L NH4NO3、250 mg/L KNO3、500 mg/L Ca(NO3)2·4H2O、200 mg/L KCl、250 mg/L、MgSO4·7H2O、550 mg/L KH2PO4、MS培養基[17]的微量元素、100 mg/L肌醇、1.0 mg/L維生素B1、1.0 mg/L維生素B6、0.5 mg/L煙酸、2.0 mg/L甘氨酸、20 g/L蔗糖和8.0 g/L瓊脂.

種子無菌萌發培養基為基本培養基.種子苗增殖培養基為含0.2 mg/L BA和1.0 g/L活性炭的基本培養基.不定芽誘導培養基為含不同濃度BA或TDZ和NAA或IBA的基本培養基.不定芽生根培養基為含1.0 g/L活性炭和0～2 mg/L IBA的基本培養基.所有培養基的pH值為5.8，培養基在121 ℃消毒15 min.

培養容器為250 mL三角瓶，每瓶盛培養基70 mL.所有材料在培養室中培養.培養室溫度(25±1) ℃，光照強度為1 500～2 000 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗.

2 結果與分析

2.1種子無菌萌發和實生苗繁殖消毒后的種子接種到基本培養基上10 d內，大約有20%的種子出現真菌污染.少數種子在培養7 d天后出現膨大，以后出現伸出子葉，并進一步形成幼苗(圖1A).在40 d的培養期間，大部分種子均沒有萌發(圖1A)，萌發率大約為3%.

將幼苗轉到新鮮的基本培養基上以后，幼苗繼續伸長.當幼苗長至6～8片葉后，將其切成小段，接種到增殖培養基上.5～7 d后，其上的側芽開始生長，25～30 d后每個莖段的基部形成了不定根，上部形成一個有6～10片葉的新幼莖(圖1B).對新幼莖進行切割與培養，可以大量繁殖幼莖.

2.2細胞分裂素和生長素對懸鈴木葉片形成不定芽的影響將增殖6代的植株上的葉片切成小塊、接種在不同的不定芽誘導培養基上.7 d后，少數比較薄、葉脈細的葉塊逐漸變褐，隨后死亡，其它的葉塊均可存活，那些有較粗葉脈的葉塊在葉脈傷口處明顯膨大、隨后形成愈傷組織，黃綠色或紅色；20 d后，一些愈傷組織分化出不定芽.隨著培養時間的延長，形成不定芽的外植體逐漸增多，不定芽逐漸伸長(見圖1C).

不同細胞分裂素和生長素及其濃度對葉片外植體形成不定芽的影響很大.在60 d的誘導過程中，在1～5 mg/L BA與0.1～0.5 mg/L NAA的各種組合中，大部分外植體可以形成愈傷組織，但幾乎不形成不定芽，只有在3 mg/L BA和0.3 mg/L NAA的培養基上有少量外植體(6.7%)分化了不定芽(結果未列出)；然而，當1～5 mg/L BA與0.1～0.5 mg/L IBA組合使用時，則不定芽誘導率顯著提高，其中以含3 mg/L BA和0.5 mg/L IBA培養基的效果最好，其不定芽的誘導率最高，為46.7%，不定芽數量最多，平均每個葉塊形成0.57個不定芽(表1).

圖1 二球懸鈴木離體植株再生(A) 種子無菌萌發形成的幼苗；(B)由種子苗繁殖所生成的植株；(C)葉片分化出不定芽；(D)不定芽生根后形成的再生植株；(E)移栽2個月后、生長健壯的再生植株.

激素/(mg/L)BAIBA接種的外植體數/個不定芽誘導率/%平均不定芽數*/個10.1907.80.1010.39010.00.1210.5906.70.0820.19012.20.1320.39023.30.2920.59027.80.3130.19022.20.2730.39034.40.4930.59046.70.5740.19017.70.2240.39036.70.4140.59015.60.1850.1908.90.0950.39014.40.1750.59018.90.24

*平均不定芽數=不定芽總數/外植體數總數,下同.

當0.5 、1.0、3.0 mg/L TDZ與0.1、0.3、0.5 mg/L IBA組合時，外植體很容易形成愈傷組織，并且愈傷組織生長快，紅色或黃白色，呈松散的粉末狀，但未見不定芽的分化(結果未列出).

表2 二球懸鈴木種子苗繼代次數對不定芽誘導的影響

2.3實生苗繼代次數對葉片形成不定芽的影響分別將第10次、15次和20次繼代所形成的植株的葉片切成小塊、接種到含3 mg/L BA和0.5 mg/L IBA的不定芽誘導培養基上.60 d后，其不定芽的誘導率分別為44.2%、40.0%和38.3%，平均每個外植體形成不定芽數分別為0.53、0.45和0.47(表2).結合植株增殖6代的結果(表1)，可以看出隨著繼代次數增加，葉片分化不定芽的能力逐漸下降，但是下降趨勢比較緩和，在繼代15次和20次時，不定芽的誘導率仍然達到40%左右，平均每個葉塊可以形成0.45個不定芽.

2.4不定芽生根與再生植株移栽二球懸鈴木的不定芽比較容易生根.在無IBA的培養基上培養7 d后，不定芽開始出現不定根，至20 d時，生根率達到98%，每株平均有3.6條不定根.但培養基中添加1～2 mg/L IBA對不定芽生根有較好的促進作用，不僅生根早、速度快，而且根多，并出現大量側根(表

表3 IBA對二球懸鈴木不定芽生根的影響

3，圖1D).經過煉苗后，將再生植株從三角瓶中取出、用自來水清洗.二球懸鈴木再生植株的不定根較脆，容易折斷，因此，對其操作要小心.在栽入基質后的頭10 d中，注意保濕和遮蔭，適時澆水，植株明顯伸長、并長出1～2片新葉.以后逐漸增加光照、常規栽培管理，60 d后，再生植株生長正常(圖1E)，移栽成活率達到92%.

3 討論

盡管以懸鈴木子葉和實生苗真葉為外植體的不定芽誘導和植株再生已有報道[13-16]，但以其實生苗無性繁殖的植株的葉片為外植體的離體再生尚少見報道.本研究比較了細胞分裂素BA或TDZ與生長素NAA或IBA組合對二球懸鈴木種子苗增殖植株的葉片分化不定芽的影響.結果表明，BA與NAA組合、TDZ與IBA組合幾乎不能誘導二球懸鈴木葉片形成不定芽，而BA與IBA組合則效果好，其最佳濃度分別為3 mg/L和0.5 mg/L；在此組合下，繁殖6代和10代的二球懸鈴木植株葉片不定芽誘導率分別為47%和44%，與以下胚軸為外植體的誘導效果[13]相當，但繁殖15代和20代后，不定芽誘導率有所下降，分別為40%和38%.

同一球懸鈴木和三球懸鈴木種子苗的真葉分化不定芽的比率相比，本研究中二球懸鈴木種子苗葉片分化不定芽的比率顯著偏低.范國強等[14]研究了三球懸鈴木種子苗第1至第7片真葉形成不定芽的條件，結果表明最佳的不定芽誘導培養基為含2～4 mg/L BA和0.1 mg/L IBA的WPM培養基，以第4至第7片真葉為外植體效果最好，不定芽誘導率可以達到70%～100%.何曉蘭等[15]發現三球懸鈴木種子苗的真葉在含2 mg/L BA、0.5 mg/L KT和0.1～0.2 mg/L IBA的WPM培養基上也有很好的不定芽誘導效果，誘導率可達70%以上.Sun等[16]發現，在含5 mg/L BA和 0.1 mg/L IBA的WPM培養基上，20～60 d苗齡的一球懸鈴木種子苗葉片不定芽誘導率高達90%.這種差異不僅與植物種類和葉片的生理狀態不同有關，也可能與基本培養基不同有關.

本研究結果證明了二球懸鈴木種子苗無性增殖15～20代的植株葉片仍然有較高的不定芽形成能力，不定芽誘導率可達40%左右，這對于培育轉基因植株來說是足夠的.因此，在試驗材料不足的情況下，則可以先對二球懸鈴木種子苗進行無性擴繁，從而保證有足夠的材料用于轉基因研究.

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