氫氯噻嗪在Caco-2細胞模型中的體外轉運研究

廖曉歡，王俊俊，韓鳳梅，杜鵬，陳勇

(湖北大學 中藥生物技術湖北省重點實驗室，武漢 430062)

氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide)是臨床上廣泛應用的口服利尿藥和抗高血壓藥，它通過抑制腎小管對鈉和水的再吸收，減少血容量和細胞外液量，降低心輸出量，達到降壓作用[1].Caco-2細胞(the human colon adenocarcinoma cell lines)來源于人類結腸癌細胞,與人小腸上皮細胞形態相似.Caco-2細胞模型是進行藥物腸道攝取和代謝研究最常用的體外細胞模型[2-3].目前，還少見關于氫氯噻嗪在Caco-2細胞模型體外轉運的研究報道.本實驗運用Caco-2細胞模型，研究轉運時間、藥物濃度、P-gp抑制劑維拉帕米(verapamil)和pH對氫氯噻嗪跨膜轉運的影響，探討氫氯噻嗪的體外吸收機制，以期為含有氫氯噻嗪的中藥復方吸收機制提供參考.

1 儀器與試劑

Olympus XDS-1B型倒置顯微鏡，Sigma公司2K15C型低溫高速離心機，上海迅達醫療儀器公司XD-711型酶標儀，島津UV-1601紫外分光光度計，Heal Forse CO2培養箱，Millipore公司Millicell-ERS型跨膜電阻儀，Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(包括DAD二極管陣列檢測器；Agilent ChemStation色譜工作站)，韓國Biotron公司真空離心濃縮機，美國Costar公司Transwell細胞培養板，Millipore公司millicell膜.

氫氯噻嗪(HCTZ，批號100309-200001，純度>98%)、維拉帕米(Ver，批號100223-200102，純度>98%)購于中國藥品生物制品檢定所；DMEM培養基購于Gibico公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；非必需氨基酸購于Sigma公司；胰酶、青霉素-鏈霉素購于吉諾生物有限公司；堿性磷酸酶試劑盒購于南京建成生物有限公司；色譜純乙腈購于美國Fisher公司.Caco-2細胞購自中國典型培養物保藏中心，實驗所用的細胞傳代數為25～60代.

2 方法

2.1細胞單層模型建立Caco-2細胞培養于37 ℃，含5%CO2的環境中，采用DMEM培養基，其中含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺以及青霉素-鏈霉素雙抗液.

隔天換一次培養液，每3 d按1∶3的比例傳代.將對數生長期細胞按1×105個·mL-1接種到12孔Transwell板上，接種后隔天換液，7 d后每日換液，培養至21 d.參照文獻方法[4]，檢測堿性磷酸酶活性和各孔跨膜電阻(跨膜電阻值大于400 Ω·cm-2)，選擇Caco-2細胞單層生長狀態完好、符合轉運條件的Millicell膜用于轉運實驗.

2.2 HCTZ的跨膜轉運實驗根據MTT的實驗結果，用pH7.4 Hank’s緩沖鹽溶液(HBSS溶液)配制濃度為100、200、500 mg·L-1的HCTZ溶液，過濾除菌.取符合轉運條件且細胞生長狀態完好的Millicell膜，用37 ℃預熱的空白pH7.4 HBSS溶液清洗細胞單層3次(此步驟在30 min內完成)，之后放入37 ℃CO2恒溫培養箱30 min.A→B側的轉運：將0.5 mL各濃度的藥物溶液加到細胞絨毛面Apical(A)側作為供給池，同時基底面Basolateral(B)側加入1.5 mL空白的HBSS溶液作為接受池.B→A側的轉運：將1.5 mL各濃度的藥物溶液加到B側作為供給池，同時A側加入0.5 mL空白HBSS溶液作為接受池.分別于30，60，90，120 min從接受池中取樣0.5 mL(A→B側的轉運)或0.2 mL(B→A側的轉運)，同時補加等量空白HBSS溶液.用HPLC測定藥物的吸收量，分別考察轉運時間、濃度、pH值、P-gp抑制劑Ver對HCTZ吸收與轉運的影響.

2.3 HCTZ定量分析條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil DOS-P(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為乙腈∶水(17∶83)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm；進樣量20 μL；柱溫25 ℃.

2.3.2 樣品前處理方法 取轉運樣品在4 ℃，12 000 g條件下高速離心10 min，取上清于37 ℃真空離心濃縮揮干，用流動相200 μL復溶后渦旋震蕩1 min，再于4 ℃，12 000 g離心10 min，取上清液20 μL進樣檢測.

2.4數據處理表觀滲透系數Papp(apparent permeability coefficients)代表藥物轉運能力的大小，Papp=(dQ/dt)/(A×C0) cm·s-1[5]

其中，dQ/dt為單位時間藥物轉運量(μg·min-1)，

A為聚碳酯膜的表面積(此實驗中為1.13 cm2)，

C0為HCTZ的初始濃度(mg·L-1).

由于每次取樣后都要補液，對藥物的通透產生了稀釋作用，因而要對藥物的累積吸收濃度TRcum(mg·L-1)進行校正，

其中An為第n個樣品通透量的測定值，VSn為第n個樣品的采樣體積，VR為接受池體積.

3 結果

3.1 HCTZ的HPLC分析方法在本色譜條件下，空白HBSS溶液對HCTZ的檢測無干擾，色譜分離良好.精密稱取HCTZ對照品適量，用空白HBSS液制成質量濃度分別為0.15、0.5、2、4、8、15 mg·L-1對照品溶液，所得系列對照品溶液按“2.3.2”項操作后進樣.以HCTZ色譜峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線為y=0.021 9x-0.192 1，r=0.999 6，線性范圍為0.15～15 mg·L-1.

配制HCTZ0.2 mg·L-1、2 mg·L-1、15 mg·L-1質控濃度的HBSS溶液，分別進樣測定峰面積，計算藥物質量濃度，以測得的質量濃度與實際質量濃度相比較，求得方法回收率為98.52%～102.01%.每樣本測定6次，連續測定3 d，HCTZ的日內精密度和日間精密度均小于5%.

3.2 HCTZ的跨膜轉運

3.2.1 時間及濃度對HCTZ轉運的影響 不同濃度HCTZ通過Caco-2細胞單層膜型的累積轉運濃度隨時間變化的結果見表1.HCTZ3個作用濃度A→B方向的轉運量在前90 min隨作用時間的延長基本增加，低、中兩個作用濃度B→A方向的轉運量前90 min隨作用時間的延長而降低.

表1 HCTZ在Caco-2細胞中的累積吸收濃度(n=3，±s) mg·L-1

根據公式Papp=(dQ/dt)/(A×C0) cm·s-1，計算出HCTZ在120 min時的表觀滲透系數，結果見表2.結果表明，HCTZPappA→B隨濃度的升高而降低，且不同濃度下PappB→A/PappA→B值均大于1.5.

表2 HCTZ在Caco-2細胞中的表觀滲透系數(n=3，±s)

*與HCTZ 100 mg·L-1比較，P<0.05.

3.2.2 Ver對HCTZ轉運的影響 Ver對HCTZ的表觀滲透系數Papp的影響結果見表3.Ver能極顯著增加HCTZ通過Caco-2單層細胞模型的PappA→B(P<0.01)，減少HCTZ通過Caco-2單層細胞模型的Papp B→A，Papp B→A/PappA→B從加入前的2.81下降到加入后的0.67，有極顯著性差異(P<0.01).

表3 Ver對HCTZ轉運的影響(n=3，±s)

**與HCTZ組比較，P<0.01.

3.2.3 pH值對HCTZ轉運的影響 pH值對HCTZ轉運的影響結果見表4.在pH6.0條件下，PappA→B是pH7.4條件下的3.9倍，有極顯著性差異(P<0.01)；同時，Papp B→A是pH7.4條件下的53%，結果亦有顯著性差異(P<0.05).

表4 pH對HCTZ轉運的影響(n=3，±s)

*與pH7.4組比較，P<0.05；**與pH7.4組比較，P<0.01.

4 討論

通過測定不同濃度受試藥物的表觀滲透系數可以確定藥物的轉運機制.若在整個質量濃度范圍內(于漏槽條件下)測得Papp值保持恒定，則被動擴散為主要轉運機制；若Papp A→B與Papp B→A相同也可確定被動擴散為主要轉運機制，若Papp B→A/PappA→B>1.5，則提示可能存在主動轉運機制[6].HCTZ 100 mg·L-1與200 mg·L-1以及100 mg·L-1與500 mg·L-1時的PappA→B均有顯著性差異(P<0.05)，因此，HCTZ在整個濃度范圍內的表觀滲透系數不是恒定不變的，且在整個濃度范圍內HCTZ的Papp B→A/PappA→B>1.5，表明HCTZ在Caco-2細胞內可能存在主動轉運機制.同時，Papp A→B值隨HCTZ濃度的增加而逐漸減小，這可能與Caco-2細胞的轉運載體有限有關.

P-糖蛋白是由多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)基因編碼的分子量為170×103的膜蛋白，存在于細胞層的絨毛面一側，系一種能量依賴性的藥物外排泵[7].P-糖蛋白存在于Caco-2細胞AP 面的細胞膜上，它將細胞內的HCTZ作為底物排出細胞外，使得A→B的轉運速率減慢，而B→A的轉運速率增大.Ver是P-糖蛋白的專屬抑制劑.本實驗在加入Ver后，基本抑制了P-gp對HCTZ的外排作用，使HCTZPappA→B值極顯著增大，轉運加快，而Papp B→A降低，轉運減慢，說明HCTZ可能是P-gp的作用底物.

HCTZ屬于弱酸性物質，在pH6.0條件下，HCTZ大量以非解離的(脂溶性)的形式存在，由于消化道上皮細胞具有脂質膜的功能，只允許脂溶性的非解離的酸或堿通過，酸性藥物在酸性條件下吸收較強.因此，HCTZ在pH6.0條件下的吸收較pH7.4時有顯著提高.

綜合上述實驗結果，我們推測HCTZ在Caco-2細胞模型中的吸收可能存在由載體介導的主動轉運，同時它還受到P-gp的外排作用.

參考文獻：

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