β -甘露聚糖酶產生菌的鑒定及其粗酶性質的研究

楊升，李立，付權，王行國

(湖北大學 生命科學學院，湖北 武漢 430062)

β-甘露聚糖酶(β-1, 4-D-mannan mannohydrolase; EC31211178) 是一類降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈β-1，4-D-甘露吡喃糖的酶[1], 它在利用現存在于一些植物如干椰子肉的胚乳、象牙棕櫚樹的堅果、瓜爾豆、洋槐、咖啡樹以及魔芋的塊莖中的各種β-甘露聚糖有著潛在的重要性[2].按其最適pH值的不同又有酸性、中性、堿性之分.目前，國內外主要用于造紙工業紙漿的漂白[3-4]、油井的破膠、降解植物膠生產低聚糖用作雙歧桿菌促生長因子,防病抗衰老的保健食品以及飼料工業中作為抗營養因子[5].微生物來源的β-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、來源穩定、提取方便等明顯優點.本研究篩選了一株高產偏堿性甘露聚糖酶的菌株,并且對該菌進行初步鑒定以及對其產酶特性和所產甘露聚糖酶的粗酶性質進行了相關酶學性質的研究分析.

1 材料和方法

1.1材料土樣采自湖北大學沙湖荒地；T4連接酶、Taq酶、dNTP和DNA marker購自TaKaRa公司，其他生化試劑均為國產分析純； M9基本培養基、LB培養基見分子克隆[6]；篩選培養基：M9基本培養基中以1%魔芋粉為唯一碳源再加入0.05%曲利本藍,發酵培養基見文獻[7]；16SrDNA引物 5’ AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3’；5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’.

1.2環境中產酶菌株的分離取5 g土樣加入到100 mL無菌水中混勻浸泡1 h左右,取適量土樣懸液稀釋,不同梯度分別涂布在篩選培養基中，37 ℃倒置培養，挑取有水解圈的單菌落，并接種于LB液體培養基，37 ℃振搖富集培養過夜.

1.3基因組總DNA的提取和質粒的分離純化參考分子克隆[6].

1.4 16SrDNA的PCR擴增以提取基因組DNA為模板，用16SrDNA引物進行PCR擴增，循環參數為：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 45 s; 56 ℃ 45 s; 72 ℃ 1.5 min; 30個循環；72 ℃ 8 min.

1.5 DNA的酶切、片段回收、連接和轉化DNA酶切參考TaKaRa公司操作說明；DNA片段回收參照V-gene Biotechnology Limited 操作說明進行；連接和轉化參考分子克隆進行[6].

1.6粗酶液的制備將菌種接入到LB培養基中,37 ℃、180 r/min培養生長至對數期,按50 mL/L接種量轉接到發酵培養基中,37 ℃、220 r/min培養32 h收獲發酵液,4 ℃下8 000 r/min離心10 min,收集上清液為粗酶液.

1.7酶活力測定8 mL 0.5%(W/V)瓜兒豆膠溶液50 ℃保溫5 min,加入0.1 mL適當稀釋的酶液,50 ℃水浴10 min,DNS法測還原糖含量.在上述條件下,每分鐘釋放相當于1 μmolD-甘露糖的還原糖所需的酶量為一個酶活單位(U).

2 結果與分析

2.1菌株的分離依1.2方法，以篩選培養基從土樣中篩選到15株周圍產生透明圈的單菌落，比較菌落直徑(C)和透明圈直徑(H),取H/C最大的菌株為研究對象，命名為102.并將其產生的粗酶液作用于1%魔芋甘露聚糖和1%瓜兒豆膠,進行TLC后[8]，結果見圖1，發現該菌株能明顯水解甘露聚糖產生寡糖.

2.2菌株的鑒定采用微生物學標準方法對細菌進行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色，發現菌株102為革蘭氏陽性，有莢膜并產芽孢.根據上述方法提取基因組DNA并擴增出16SrDNA(圖2),16SrDNA 的測序比對后發現其與芽孢桿菌同源性達到96%.因此,將菌株102命名為Bacillussp.102.

2.3 粗酶液的性質

2.3.1 不同溫度對酶活的影響 底物分別在35、40、45、50、55 ℃下保溫5 min,加入0.1 mL酶液,反應10 min后測酶活.得出最適反應溫度為50 ℃(圖3).

圖1 粗酶液水解甘露聚糖TLC圖1：葡萄糖, 2：D-甘露糖, 3：粗酶液水解1%魔芋甘露聚糖2 h, 4: 粗酶液水解1%瓜兒豆膠2 h, 5:空白對照.

圖2 Bacillus sp.102的16SrDNA PCR圖1：λ-EcoT14 I digest, 2:Bacillus sp.102總DNA,3:16SrDNA PCR產物

圖3 溫度對酶活的影響

2.3.2 酶作用最適pH值 用不同pH值的緩沖液分別配制不同pH值的底物,每支管分別加入8 mL底物保溫5 min,加入0.1 mL酶液,反應10 min后測酶活.測得最適反應pH值為9.0,即為弱堿性條件下其酶活性最大.并且在相同的PH條件下，Tris-HCl緩沖液與磷酸緩沖液相比，Tris-HCl對該酶活有抑制作用(圖4).

2.3.3 pH值對酶穩定性的影響 粗酶液用不同pH值緩沖液分別稀釋50倍,各取10 mL于室溫保溫3 h,測剩余酶活.發現酶在中性和偏堿性時穩定性較好,酸性條件下酶活降低較快,說明該酶更適合在中性和偏堿性環境發生作用(圖5).

2.3.4 溫度對酶穩定性的影響 取酶液各5 mL,分別于4、25、37、45、60 ℃保溫30 min,測剩余酶活.測得50 ℃保溫30 min后酶活剩余81.6%,60 ℃保溫30 min后酶活保留26.4%(圖6),可見該酶的熱穩定性較差.

圖4 pH對酶活的影響

圖5 pH對酶穩定性的影響

圖6 溫度對酶穩定性影響

3 討論

本研究采用平板篩選和液體培養驗證酶活的方法,篩選的菌株酶活較高,產酶迅速.而且經過簡單的發酵條件優化,該菌所產的粗酶液組分中甘露聚糖酶的成分占了很大的比例,粗酶液的降黏效果明顯;粗酶液水解魔芋甘露聚糖和角豆膠的產物均以甘露寡糖為主,這對該酶進一步的分離純化是一個很大的優勢,而且如果應用到對酶純度要求不高的行業,該菌作為生產菌株會極大地降低生產成本.

試驗結果表明該菌株所產粗酶在偏堿性條件下活性及穩定性都高于酸性條件，從而說明該酶在堿性條件下的工業應用擁有一定潛力.

參考文獻：

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