E.coli酪氨酸轉氨酶的純化與非天然氨基酸的底物特異性檢測

陳茹，王行國,何婷，張萍萍

(湖北大學 生命科學學院，湖北 武漢 430062)

芳香族氨基酸轉氨酶由tyrB基因編碼,其單亞基分子量為45 ku，為二聚體.等電點pI為4.6～4.8.最適反應pH為7.0.主要用于合成苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和亮氨酸[1].非天然氨基酸在工業，食品上應用廣泛，它還是許多天然與合成藥物的組成成分[2].微生物酶轉化法生產非天然氨基酸與傳統化學方法相比，具有立體選擇性強，原材料易得，反應簡單，容易控制，條件溫和，操作簡便，穩定性好，成本較低，污染少等特點.

我們將酪氨酸轉氨酶基因(tyrB)通過表達載體pET23a轉入宿主菌E.coliBL21(DE3)，在誘導劑IPTG下大量表達，將破細胞得到的上清蛋白依次通過硫酸銨分級分離、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析后，獲得了純的酪氨酸轉氨酶.運用薄層層析技術(TLC)檢測到轉氨酶的活性，分別以一些非天然氨基酸作為底物，檢測對這些非天然氨基酸的底物特異性的高低.為以后構建具有非天然氨基酸底物特異性的酪氨酸轉氨酶工程菌打下基礎.

1 材料與方法

1.1材料菌種為本實驗室構建的大腸桿菌(E.coli)重組菌株BL21(DE3)轉pET23a-tyrB.

1.2 方法

1.2.1 酪氨酸轉氨酶的誘導表達[3]從-86 ℃冰箱接實驗室構建好的重組菌株BL21(DE3)轉pET23a-tyrB入已滅菌的含10 μL的100 mg/mL氨芐青霉素10 mL LB液體培養基中，置于搖床37 ℃活化12 h.取5 mL活化好的BL21(DE3)轉pET23a-tyrB入已滅菌的500 mL的含500 μL的100 mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃搖床培養4 h至OD600在0.6～0.9之間，加入250 μL的IPTG，37 ℃誘導12 h.

1.2.2 酪氨酸轉氨酶粗酶液的提取[4]將500 mL的菌液離心5 000 r/min,15 min.棄上清，用15 mL,50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl緩沖液洗菌，并重復洗一次.用20 mL,50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl懸浮菌體,超聲波40 W/28 min破細胞.離心8000 r/min,20 min,取上清，用20 mL,50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl懸浮備用.

1.2.3 硫酸銨溶液分級分離 為找出分級分離的最佳條件，將上清蛋白依次用20%,30%,40%,50%,60%,65%(NH4)2SO4沉淀，將各濃度沉淀下來的蛋白用SDS-PAGE電泳檢測，找到最初沉淀目的蛋白的(NH4)2SO4濃度.下次直接用該濃度前的一個(NH4)2SO4濃度直接去掉雜蛋白，上清蛋白用能沉淀目的蛋白的最大(NH4)2SO4濃度沉淀下來，并用適量的50 mmol /L pH8.5的Tris-HCl懸浮.

1.2.4 透析 將上一步懸浮好的蛋白液裝入透析帶，加入700 mL，50 mmol/L pH8.5 Tris-HCl透析液和攪拌子的燒杯中，每隔約3 h換一次新透析液，共透析4次.取出透析后的樣品，離心12 000 r/min,15 min,取上清備用.

1.2.5 離子交換層析[5]選用Q-sepharose Fast Flow填料裝柱，用約4倍柱體積的50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl 平衡柱子，流速控制在0.8 mL/min,將上一步處理好的樣品上柱， 0～0.5 mol/L的NaCl梯度洗脫并收集，設置每管蛋白的收集時間為4 min.用分光光度計測A280并繪制洗脫圖譜以及SDS-PAGE檢測.根據檢測結果和洗脫圖譜，合并目的蛋白峰所在的幾管,加(NH4)2SO4至40%的濃度,并在4 ℃保存.下一步上樣使用.

1.2.6 疏水層析[6]選用 Butyl Sepharose 4B填料裝柱，用約4倍柱體積的含40%(NH4)2SO4的50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl平衡柱子,流速為0.8 mL/min.將上一步處理好的樣品上疏水柱.選用45%～0%(NH4)2SO4梯度洗脫并收集蛋白，設置每管蛋白的收集時間為4 min.用分光光度計測A280并繪制洗脫圖譜以及SDS-PAGE檢測.根據檢測結果和洗脫圖譜，合并目的蛋白峰所在的幾管,加(NH4)2SO4至65%的濃度,并在4 ℃保存.下一步上樣使用.

1.2.7 凝膠過濾層析[7]選用Sepharose 4 FF填料裝柱，用約600 mL的5 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl pH8.5以平衡柱子，流速為0.8 mL/min，將上一步處理好的樣品上柱.加入200 mL的等度洗脫液含5 mmol/L NaCl的50 mmol /L Tris-HCl pH8.5,流速為0.8 mL/min.并收集,利用分光光度計測量每管的A280值，繪制洗脫圖譜.用SDS-PAGE檢測目的蛋白位置.

1.2.8 薄層層析(TLC)檢測轉氨酶活性及非天然氨基酸底物特異性[8]展層液按正丁醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶3的體積比配制而成，將畫好點樣位置的硅膠板在裝有5 mL展層液的層析缸中預跑，待展層液跑完后，取出硅膠板，于通風櫥中晾干烘干.用小槍將樣品點在標好的位置，標準樣點2 μL，樣品點10 μL.向層析缸中加入5 mL展層液，將硅膠板放入，待溶液前沿上升距薄板上沿約1 cm處，取出，晾干.用茚三酮溶液均勻噴霧，置烘箱60 ℃～80 ℃或用吹風機顯色5～15 min，即可見各種氨基酸的層析斑點，照相記錄保存.

2 結果與討論

2.1 TyrAT重組菌株粗酶液SDS-PAGE電泳檢測結果菌種表達后破細胞，得到的上清和沉淀經SDS-PAGE電泳，如圖1可以看出目的蛋白主要集中在上清中.

2.2 TyrAT轉氨酶的硫酸銨分級分離結果不同飽和度的硫酸銨沉淀的蛋白電泳結果如圖2所示，40%和45%時只有少量目的蛋白沉淀下來，硫酸銨飽和度達到65%時所有蛋白幾乎全部沉淀下來，因此確定可用45%硫酸銨沉淀去除一部分雜蛋白,而用65%硫酸銨沉淀TyrAT轉氨酶.

2.3 TyrAT轉氨酶層析分離分離色譜見圖3.

2.4 TyrAT轉氨酶純化后的SDS-PAGE結果將TyrAT轉氨酶的粗酶液經硫酸銨分級分離、離子交換層析、疏水層析和凝膠過濾層析后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后，結果如圖4，經過這4步純化后，已得到較純的TyrAT轉氨酶.

2.5 TLC檢測結果

2.5.1 利用自身底物酪氨酸檢測酶活 設3個反應管，每管均加入300 μLα-酮戊二酸、30 μL酪氨酸、PLP，其中反應管1和反應管2另加入60 μL已純化的TyrAT酶，均反應60 min,反應管1和對照管在37 ℃，反應管2在50 ℃反應.

圖1 TyrAT轉氨酶的破細胞上清與沉淀M：蛋白質marker；1:破細胞沉淀；2：破細胞上清.

圖2 TyrAT轉氨酶硫酸氨分級分離M:蛋白質maker；1：65%(NH4)2SO4的沉淀；2：60%(NH4)2SO4的沉淀；3：50%(NH4)2SO4的沉淀；4：45%(NH4)2SO4的沉淀；5：40%(NH4)2SO4的沉淀；6：35%(NH4)2SO4的沉淀.

圖3 TyrAT轉氨酶層析分離色譜圖(a) Q-sepharose Fast Flow陰離子交換層析分離色譜圖；(b) Butyl-Sepharose 4B疏水層析分離色譜圖； (c) Sepharose 4 FF凝膠過濾層析分離色譜圖

在硅膠板上依次點2 μL谷氨酸，2 μL酪氨酸，10 μL對照管反應液、10 μL反應管1反應液、10 μL反應管2反應液.結果顯示兩反應組均有谷氨酸生成，純化的轉氨酶有活性；對照組無谷氨酸生成，未反應.兩個溫度下轉氨酶活性相差不大.如圖5.

圖4 TyrAT經4步分離純化后的SDS-PAGE圖M:蛋白質Marker；1:粗酶液；2:經硫酸銨分級分離后的蛋白；3:經離子交換層析后的蛋白；4:經疏水層析后的蛋白；5:經凝膠過濾層析后的蛋白.

圖5 以酪氨酸為底物的酶活反應TLC圖 1：谷氨酸；2：酪氨酸；3：對照管；4：反應管1；5：反應管2.

2.5.2 非天然氨基酸底物特異性檢測 我們將純化出的TyrAT轉氨酶以4種非天然氨基酸為底物，TLC檢測轉氨反應，即TyrAT轉氨酶是否對該非天然氨基酸有底物特異性.設了2個最佳溫度37 ℃和50 ℃.反應管1在37 ℃下進行，反應管2在50 ℃下進行.

圖6 以4種非天然氨基酸為底物的酶活反應TLC圖(a)-1：L-正纈氨酸；(b)-1:L-新戊基甘氨酸；(c)-1:L-叔亮氨酸；(d)-1:D-正亮氨酸；2: 谷氨酸；3：對照管；4：反應管1；5：反應管

TLC結果顯示,以L-正纈氨酸為底物，L-正纈氨酸在37 ℃和50 ℃下均無反應；以L-新戊基甘氨酸為底物，L-新戊基甘氨酸在37 ℃和50 ℃下均無反應；以L-叔亮氨酸為底物，L-叔亮氨酸在50 ℃下有反應；以D-正亮氨酸為底物，D-正亮氨酸在37 ℃，50 ℃下均有反應.且50 ℃下效果更好.這為下一步改造酶的性質，采用定向進化的方法改變酪氨酸轉氨酶的底物特異性，構建產非天然氨基酸的工程菌株打下了基礎.

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