用5′加尾長引物進(jìn)行AFLP片段的直接測序

劉耘，陳勛，李強(qiáng)

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，湖北 武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳改良國家重點(diǎn)實驗室，湖北 武漢 430070)

AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)是基于DNA限制性片段選擇性擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)[1].其主要技術(shù)流程如下：首先用一種識別六堿基與一種識別四堿基的限制性內(nèi)切酶如EcoRI和MseI消化基因組DNA，酶切產(chǎn)物與接頭連接，連接產(chǎn)物經(jīng)預(yù)擴(kuò)增后，再用含接頭、酶切位點(diǎn)及3個特異堿基的選擇性引物對預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色，獲得多態(tài)性AFLP標(biāo)記.AFLP標(biāo)記具有DNA用量少、信息量多、不需要預(yù)先知道擴(kuò)增基因組的序列信息以及物種之間可通用等優(yōu)點(diǎn).

自AFLP標(biāo)記技術(shù)發(fā)明以來，已廣泛應(yīng)用于DNA指紋分析、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、基因定位、遺傳作圖、分子標(biāo)記輔助育種等研究中.由于AFLP技術(shù)能夠在一次PCR反應(yīng)中檢測大量的遺傳位點(diǎn)，而且不需要知道目標(biāo)基因區(qū)段的基因組序列信息，因此特別適合于與BSA分析(Bulked Segregant Analysis)技術(shù)[2]相結(jié)合尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記.例如，Yi等[3]用2560對AFLP引物結(jié)合BSA方法篩選與隱性核不育基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，獲得7個與隱性核不育基因Bnms1緊密連鎖的AFLP標(biāo)記，為Bnms1基因的克隆奠定了基礎(chǔ).由于AFLP過程比較繁瑣，不適合于大群體的高通量篩選.通常，人們先將與目標(biāo)性狀連鎖的AFLP標(biāo)記測序，再將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成位點(diǎn)特異的STS(Sequence-Tagged Sites)、CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)或SCAR(Sequence-Characterized Amplified Region)標(biāo)記，然后再進(jìn)行高通量檢測.AFLP標(biāo)記片段測序有兩種策略：第一種策略是先將AFLP標(biāo)記回收克隆，再與T/A克隆載體連接，挑3個以上陽性克隆進(jìn)行測序，通過序列拼接獲得無錯誤的標(biāo)記序列[4].這種方法耗時較長，成本也較高.第二種策略是回收AFLP標(biāo)記片段，再用原來的選擇性引物擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物直接測序.但是，測序的前30個核苷酸通常無法讀出或質(zhì)量較差，需要從兩端分別測序，增加了實驗成本.

本研究中，我們報道一種AFLP片段快速直接測序方法，只需一次測序反應(yīng)就能獲得AFLP標(biāo)記片段的全序列.

1 材料與方法

1.1材料本研究所用的油菜品種為中油821(黑籽)和人工合成甘藍(lán)型油菜品系No.2127(黃籽)，分別從田間取新鮮葉片提取基因組DNA.

1.2 AFLP分析用EcoRI和MseI消化中油821和No.2127總DNA[4]，AFLP操作流程參考陸光遠(yuǎn)等[5]的程序進(jìn)行.

1.3擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳和凝膠染色AFLP預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物分別用選擇性引物組合E+AAA/M+CAC，E+AAT/M+CAC，E+AAC/M+CAC，E+AAG/M+CAC，E+ATA/M+CAC和E+ATT/M+CAC擴(kuò)增(其中E的序列為GACTGCGTACCAATTC，M的序列為GATGAGTCCTGAGTAA).AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離參照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行.取選擇性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物4 μL上樣，85 W電泳2 h.電泳完畢，小心剝下膠板，用改進(jìn)的Bassam法染色[7].

1.4 AFLP標(biāo)記片段的回收在聚丙烯酰胺凝膠上選擇要回收的AFLP條帶，按Liu等[8]的方法進(jìn)行回收和再擴(kuò)增.具體操作如下：用刀片輕輕將AFLP條帶挖下來，并轉(zhuǎn)入0.5 mL離心管中，加入50 μL ddH2O，然后用一次性無菌吸頭搗碎，沸水煮沸10 min，再離心2 min(8 000 r/min)，取上清液作DNA模板.

1.5 AFLP標(biāo)記片段的再擴(kuò)增AFLP片段再擴(kuò)增反應(yīng)包括一條AF2SC引物和一條選擇性引物.AF2SC是EcoRI接頭端的引物，其序列為CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCT-TGCTCGTAGACTGCGTAC，共52個堿基，其中下劃線部分為通用的M13RV測序引物序列，斜體部分為EcoRI接頭序列.MseI接頭端引物為各AFLP片段的選擇性引物，包含MseI接頭的核心序列和3個選擇性堿基.回收的AFLP片段用如下反應(yīng)體系進(jìn)行再擴(kuò)增：取6 μL回收的AFLP片段上清液，0.2 mmol/L AF2SC，0.2 mmol/L MseI接頭端選擇性引物，2.0 mmol/L Mg2Cl，0.1 mmol/L dNTP，1×Taq DNA聚合酶緩沖液，1.5 U Taq DNA聚合酶，反應(yīng)體積為25 μL.PCR循環(huán)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，然后經(jīng)94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，最后在72 ℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上檢測，擴(kuò)增片段清晰的PCR產(chǎn)物用于DNA直接測序.

1.6 DNA片段的直接測序在進(jìn)行DNA測序反應(yīng)前，先用蝦磷酸化酶和核酸外切酶去除多余的dNTP和引物.反應(yīng)條件如下：在10 μL的反應(yīng)體系中，加入5 μL PCR產(chǎn)物，1.25 U核酸外切酶，0.65 U蝦磷酸化酶，在37℃條件下反應(yīng)1 h，然后在80 ℃保溫20 min終止反應(yīng).取3 μL處理過的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序.測序反應(yīng)按Applied Biosystems公司的說明書進(jìn)行(ABI,FosterCity,CA,USA).測序反應(yīng)產(chǎn)物用ABI3130測序儀電泳分離.

2 結(jié)果

2.1 AFLP片段直接測序的原理從聚丙烯酰胺凝膠中回收AFLP片段后，直接用加長的AF2SC引物和MseI選擇性引物進(jìn)行再擴(kuò)增.擴(kuò)增后，在AFLP片段末端引入了36 bp，其5′末端的18 bp是通用測序引物M13RV序列，在M13RV和EcoRI酶切位點(diǎn)之間是34 bp引入序列和接頭序列.直接用M13RV引物對PCR再擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，前30個質(zhì)量較差的堿基正好落在已知序列上，而之后的來源于油菜基因組的序列質(zhì)量比較好.該方法的基本原理如圖1所示.

圖1 AFLP片段直接測序的原理a.AF2SC引物與AFLP片段的配對；b.用AF2SC和MseI引物進(jìn)行AFLP片段再擴(kuò)增；c.擴(kuò)增后的AFLP片段比原來增加了36 bp.圖中帶下劃線的部分表示M13RV測序引物， 斜體部分表示AF2SC與AFLP片段配對的序列

2.2 AFLP片段擴(kuò)增和再擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜中油821和No.2127總DNA經(jīng)EcoRI和MseI酶切后，分別與EcoRI和MseI接頭連接，經(jīng)預(yù)擴(kuò)增后，再分別用選擇性引物組合E+AAA/M+CAC，E+AAT/M+CAC，E+AAC/M+CAC，E+AAG/M+CAC，E+ATA/M+CAC和E+ATT/M+CAC擴(kuò)增.從圖2中可以看出，每對引物組合擴(kuò)增出20～50條AFLP條帶，分布在80～400 bp之間(圖2).從聚丙烯酰胺凝膠上選擇18個清晰的AFLP片段，挖膠回收.然后分別用AF2SC和MseI選擇性引物再擴(kuò)增，每個AFLP片段都擴(kuò)增得到清晰的條帶(圖3).

圖2 AFLP標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

圖3 AFLP片段回收后再擴(kuò)增結(jié)果 泳道1～18是不同AFLP片段再擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)記 GeneRuler 1 Kb DNA ladder (Fermentas).

2.3 AFLP片段的測序?qū)⑸鲜鰯U(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸外切酶和蝦磷酸化酶消化，然后用M13RV引物直接進(jìn)行測序.從測序結(jié)果可以看出，前30個堿基序列質(zhì)量相對較差，隨后質(zhì)量較好.經(jīng)過序列比對，每個片段的5′端都可以找到接頭序列、EcoRI酶切位點(diǎn)和3個選擇性堿基.在其3′末端也可以找到3個選擇性堿基、MseI酶切位點(diǎn)和接頭序列.表明利用該方法，只需一次反應(yīng)就能將AFLP片段序列完全測通(圖4).

圖4 AFLP片段再擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的結(jié)果

3 討論

在作物重要農(nóng)藝性狀基因的定位與克隆研究中，通常利用AFLP技術(shù)篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，然后用緊密連鎖的AFLP標(biāo)記分析大群體，篩選重組單株[3].但是，由于AFLP標(biāo)記技術(shù)比較繁瑣，不適合于對大群體進(jìn)行高通量分析.必須將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成STS、CAPS或SCAR標(biāo)記，才能用于大群體重組單株的高通量篩選.而轉(zhuǎn)化成STS、CAPS或SCAR標(biāo)記的前提是先測定AFLP片段的序列.目前，AFLP片段的兩種測序策略比較費(fèi)時，而且實驗成本也比較高.用5′末端長引物對AFLP片段進(jìn)行再擴(kuò)增后，在AFLP片段中引入來一段已知序列.用引入片段的5′末端序列對再擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，只需一次反應(yīng)就能獲得AFLP片段的序列，大大縮短了時間，降低了實驗成本.

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