原兒茶酸在大鼠血漿中的藥代動力學研究

蔡文濤，柳力，陳勇，韓鳳梅

(湖北大學 中藥生物技術湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430062)

原兒茶酸(protocatechuic acid，簡記為：PA)廣泛存在于無梗五加、葒草等常用中草藥中[1-2]，是一種水溶性酚酸成分，不僅具有顯著降低心肌耗氧量，提高心肌耐氧能力，減慢心率等藥理作用[3]，還有明顯抗乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)的作用．研究表明，原兒茶酸對 HepG 2.215 細胞中HBV-DNA及抗原有較強抑制作用，對HBeAg的抑制作用要強于對HBsAg的抑制作用，且其作用機制不同于目前廣泛使用的核苷類似物[4]．目前關于原兒茶酸的藥動學研究資料很少，僅有1篇文獻報道了大鼠單劑量給藥后其藥動學[5]．文中研究低、中、高3個劑量的原兒茶酸對大鼠灌胃給藥后的藥代動力學．

1 實驗材料

1.1儀器Agilent 1100型 HPLC儀，DAD UV-Vis檢測器，Agilent Chemstation數據處理系統(Agilent公司)，BioTron Ecospin 3180C離心真空濃縮儀(BioTron公司)，Sigma 2K15C臺式高速離心機(Sigma 公司)，PHS-2C精密數顯酸度計(上海偉業儀器廠)．

1.2藥品與試劑原兒茶酸(純度≥98%，購于施瑞科技武漢有限公司)，對羥基苯甲酸(簡記為：PHBA，純度≥98%)，乙腈(色譜純)，Millipore超純水，肝素(150 U·mg-1)．

1.3實驗動物SPF級 Wistar大鼠：體重(200±20) g，雌雄各半，購于湖北省疾病預防控制實驗動物研究中心，合格證號：SCXK(鄂)2003-0005．

2 實驗方法

2.1色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(V∶V=14∶86，pH=2.1)；流速：1.2 mL/min；檢測波長：260 nm；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃．

2.2血漿樣品的處理精密量取血漿 200 μL, 加入 40 μL純水，20 μL 30 mg/L對羥基苯甲酸內標溶液，渦旋振蕩 1 min，加 100 μL甲醇，500 μL乙腈，渦旋振蕩 1 min后[5]，12 000 r/min離心 10 min，取上清液置于離心真空濃縮機中 45 ℃揮干，殘渣用 100 μL流動相復溶，12 000 r/min離心 5 min，取上清液 20 μL進樣．

2.3動物實驗取SPF級 Wistar大鼠 18 只，隨機分成 3 組，每組 6 只，雌雄各半，給藥前禁食 12 h，不禁水.按10 mL·kg-1量分別灌胃低、中、高劑量(合50、100、150 mg原兒茶酸/kg劑量)藥液，分別于給藥后10，20，30，45，60，75，90，120，180，300，480 min 眼底靜脈叢取血0.5 mL，立即移入經肝素處理的 1.5 mL 離心管中，3 000 r/min 離心10 min，取血漿，于-20 ℃ 保存待測．

3 結果

3.1方法的專屬性在上述色譜條件下，測得空白血漿、加原兒茶酸和對羥基苯甲酸內標的空白血漿、大鼠灌胃原兒茶酸后的血漿樣品的色譜圖(圖 1)．由圖示，血漿中內源性物質與原兒茶酸的可能代謝物不干擾原兒茶酸和對羥基苯甲酸內標的測定．

A：空白血漿

B：添加對照品和內標的空白血漿

C：大鼠給藥后的血漿樣品

3.2線性范圍取大鼠空白血漿 200 μL，加入40 μL原兒茶酸系列對照品溶液，20 μL 30 mg/L對羥基苯甲酸內標溶液，配制成不同濃度的原兒茶酸標準樣品，除不加 40 μL 純水外，其余按2.2項操作，以原兒茶酸與對羥基苯甲酸的峰面積比值(Y)對原兒茶酸的濃度(X)作圖，得線性回歸方程為Y=0.179 8X+0.003 4，r=0.998(n=6)，線性范圍：0.15～80 mg/L，最低定量限為 0.15 mg/L(S/N>10)．

3.3精密度和準確度配制含原兒茶酸0.5、3、20 mg/L(低、中、高)3 個濃度血漿樣品，連續測定 3 d.以當天的標準曲線計算原兒茶酸的濃度，求得方法的精密度和準確度，結果見表 1．

3.4提取回收率配制含原兒茶酸0.5、3、20 mg/L 3個濃度血漿樣品，以測得的目標物的峰面積與相應標準對照品峰面積的比值作為提取回收率，結果見表 2．

表 1 方法的精密度和準確度

表 2 血漿中PA與PHBA的提取回收率

圖2 灌胃 50、100 和150 mg/kg 原兒茶酸后大鼠體內的血藥濃度-時間曲線

3.5穩定性配制含原兒茶酸0.5、3、20 mg/L 3 個濃度血漿樣品，分別置于室溫下保存 1 d和-20 ℃ 冰箱中保存 1 周后處理并測定，考察樣品的穩定性．結果樣品測定的RE均小于5%，穩定性良好．

3.6原兒茶酸在大鼠血漿中的藥代動力學研究大鼠灌胃低、中、高3個劑量原兒茶酸的平均血藥濃度-時間曲線見圖 2.實驗數據采用3P97 藥代動力學軟件進行分析.根據擬和優度值及 AIC 最小原則，結合測量值與估算值間的相關性、數據的精密度，得相關藥動學參數見表3，原兒茶酸在大鼠體內的藥動學過程符合二室開放模型，權重為1/C2．

表 3 大鼠單次灌胃 PA 50、100和150 mg/kg后的藥動學參數±s)

4 討論

由圖1顯示灌胃原兒茶酸后的大鼠血漿樣品中有許多雜峰，經DAD光譜掃描發現其紫外吸收圖譜與原兒茶酸的極其相似，推測應為其代謝物．我們曾用大鼠肝微粒體對原兒茶酸進行體外溫孵代謝時，卻沒有發現相應代謝物.由于肝微粒體中主要是Ⅰ相代謝酶，故推測PA在大鼠體內的生物轉化主要以Ⅱ相代謝為主．

本文中通過低、中、高3個劑量原兒茶酸在大鼠體內的藥動學研究發現，當PA灌胃劑量由 50 mg/kg增至 100 mg/kg時，AUC由(361±120)增至(3 492±767) mg·L-1·min、Cmax由(2.19±1.06)增至(30.41±7.27) mg·L-1，即劑量增加了1倍，而AUC增加了8.67倍，Cmax增加了12.89倍，CL從(0.14±0.04)下降至(0.03±0.01) mg·kg-1·min-1/mg·L-1.當PA灌胃劑量由100 mg/kg增至 150 mg/kg時，AUC由(3 492±767)增至(5 218±1 860) mg·L-1·min、Cmax由(30.41±7.27)增至(49.33±28.43) mg·L-1，即劑量增加了0.5倍，而AUC增加了0.49倍(R2=1)，Cmax增加了0.62倍(R2=0.996 8)，CL基本不變，線性良好．

由以上數據對比知，原兒茶酸在劑量由 50 mg/kg增至 100 mg/kg時藥動學過程呈現出非劑量依賴，隨著劑量的增加，AUC和Cmax增加得更快，而CL卻下降，表明體內藥物清除變慢，藥物積蓄使AUC和Cmax急劇升高，說明在此劑量范圍，藥動學過程呈非線性特征．原兒茶酸在劑量由 100 mg/kg增至 150 mg/kg時藥動學過程呈現出劑量依賴，說明在此劑量范圍，藥動學過程呈線性特征．

對于其產生非線性特征的原因，存在酶飽和等諸多因素，需要通過進一步實驗進行研究確證．

我們曾研究了原兒茶酸對小鼠的最大給藥量，結果表明給予最大容量最大濃度(5 g/kg)的原兒茶酸時，其毒性非常小，同時參考文獻[5]，文中設置上述低、中、高劑量．雖然原兒茶酸在大鼠體內呈非線性藥動學特征，推測其因給藥劑量變化而產生的毒副反應的可能性較小．但在進行臨床相關試驗時，由于物種差異、生理病理狀況等復雜因素，還是有必要對其進行血藥濃度的實時監測．

參考文獻：

[1] 李勇軍,何迅,劉麗娜,等.葒草化學成分的研究[J].中國中藥雜志,2005,30(6):444-446.

[2] 高曉忠,周長新,張水利,等.毛茛科植物石龍芮的化學成分研究[J].中國中藥雜志,2005,30(2):124-126.

[3] 饒曼人,劉廣余,高長忠,等.原兒茶酸對缺血區心肌代謝及心肌梗塞范圍的影響[J].中國藥理學報,1988,9(1):27-30.

[4] 劉厚佳,胡晉紅,孫蓮娜,等.原兒茶酸等化合物對HBV-DNA轉染人肝細胞株的作用[J].第二軍醫大學學報,2001,22(7):661-663.

[5] 韓瑛,熊志立,楊春娟,等.高效液相色譜法測定大鼠血漿中的原兒茶酸[J].色譜,2007,25(2):207-210.