水楊酸、水楊酸甲酯對亞硝胺合成阻斷作用研究

黃娟，馬建華

(集美大學 生物工程學院，福建 廈門 361021)

亞硝胺是目前所知的最強的化學致癌物質之一，亞硝胺能引起人和動物肝臟等多種器官的惡性慢性腫瘤.在人體胃的酸性環(huán)境中，過量的亞硝酸鹽也可以轉化為亞硝胺，清除體內亞硝酸鹽是防止癌癥的有效途徑[1].水楊酸(SA)和水楊酸甲酯(MS)天然存在于一些植物體內，具有鎮(zhèn)靜止痛、清熱解毒等功能，是醫(yī)藥、食品、香料、染料和農藥等工業(yè)的重要中間體[2-4].近年來，SA、MS的生物功能不斷被發(fā)現(xiàn)，如有關SA、MS是植物對外界傷害(機械傷害，食草動物、昆蟲、病原菌浸染)做出反應而表達抗性基因的信號分子的相關研究報道[5].但目前SA、MS諸多生物功能的分子機制尚不完全明了，SA、MS是否具有對亞硝胺合成的阻斷效果呢？本研究工作以254 nm紫外光為輻照源，利用穩(wěn)態(tài)分析方法分別測定SA、MS對亞硝胺合成的阻斷率，同時探討濃度、pH值、反應時間等影響因子對SA、MS阻斷效果的影響，并與抗壞血酸作用效果進行對照.所獲研究結果將不僅有助于進一步開拓SA、MS的生物功能，而且可為進一步闡釋它們光生物活性作用的分子機制提供重要依據.

1 實驗部分

1.1儀器和試劑ZF-20C 暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠)，CARY50紫外-可見分光光度儀(東南化學儀器有限公司)，UV-2000紫外-可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)，HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，F(xiàn)A51001電子天平(上海精科天平有限公司)，pHS-3TC(0.01級)精密數(shù)顯酸度計(上海天達儀器有限公司).

水楊酸(SA)：廣東汕頭西隴化工廠；水楊酸甲酯(MS)：中國國藥(集團)上海化學試劑分公司；抗壞血酸(Vc)：廣東汕頭西隴化工廠；其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水.

1.2實驗方法控制適宜的酸性條件，用二甲胺或鹽酸二甲胺與溫熱的亞硝酸鈉反應，即可合成二甲基亞硝胺.其化學反應方程式為[6]：

其實質為：

當向樣品(SA或MS)溶液中加入二甲胺與亞硝酸鈉時，樣品優(yōu)先與亞硝酸鈉作用，使得二甲胺不能與亞硝酸鈉反應，達到阻止亞硝胺生成的目的.據此可以比較相同條件下生成亞硝胺量的多少來反映樣品阻斷能力的強弱.

在紫外光照射下，二甲基亞硝胺可分解成二甲基仲胺和亞硝酸根，反應式如下：

亞硝酸根與對氨基苯磺酸重氮化后，再與α-萘胺偶合生成紅色化合物，使用Cary 50紫外分光光度計在400～800 nm波長范圍內掃描該化合物的最大吸收波長，測出該化合物的吸光度值，即可計算上述反應液中亞硝胺含量的多少[7].

在空氣飽和的狀態(tài)下，以254 nm為紫外輻照波長，采用紫外光解法，操作及測定方法按照文獻[7]進行，同時做濃度、反應時間等影響因子實驗，并以Vc做對照.

阻斷率/%=[(A0-A)/A0]×100

式中：A0，未加樣品時NaNO2的吸光度值(以試劑空白溶液為參比溶液)；A， 加入樣品后NaNO2的吸光度值(以樣品為參比溶液).

2 結果與分析

2.1吸收光譜使用Cary 50紫外分光光度計在400～800 nm波長范圍內掃描最大吸收波長，如圖1.由圖可以看出，加樣品(SA、MS和Vc)與不加樣品(Blank)時NaNO2經著色反應后的最大吸收峰在525 nm處，這與文獻[7]報道的一致，故選擇525 nm為檢測波長.

圖1 吸收光譜圖

2.2紫外照射波長對亞硝胺合成阻斷率的影響在25 mL比色管中均加入相同體積的樣品(SA或MS)溶液，按照1.2的方法，分別測試反應液在365 nm 和254 nm 紫外波長照射下對亞硝胺的阻斷率，結果見表1.

表1 不同紫外波長照射下相同濃度的SA與MS對亞硝胺的阻斷率

觀察表1可知，254 nm紫外波長照射下，相同濃度的SA、MS對亞硝胺的阻斷作用比365 nm 照射下稍微強些，可能是紫外波長不同照射能量不同，導致二甲基亞硝胺的分解率不同.以下選擇254 nm作為紫外照射波長進行實驗研究.

表2 樣品濃度與對亞硝胺合成的阻斷率的劑量關系

2.3濃度對亞硝胺合成阻斷效果的影響在25 mL比色管中均加入不同體積的樣品(SA或MS)溶液，按照1.2的方法，測試不同濃度的樣品在254 nm 紫外波長照射下對亞硝胺的阻斷率，結果見表2.

由表2可以看出，在0.08～1.28 mmol/L范圍內，樣品濃度與亞硝胺合成的阻斷效果呈明顯的劑量關系，但當濃度達到1.28 mmol/L時，阻斷率增加趨緩.該范圍內SA、MS對亞硝胺合成的阻斷率最大分別可達55.91%、56.18%.說明SA和MS均可有效地阻斷亞硝胺的合成，且相同濃度的SA和MS對亞硝胺阻斷作用能力的強弱順序為MS >SA.

2.4反應時間對亞硝胺合成阻斷效果的影響在25 mL比色管中均加入6.0 mL濃度為4 mmol/L的的樣品(SA或MS)溶液，按照1.2的方法，分別測試樣品液反應不同時間對亞硝胺的阻斷率，結果見表3.

表3 反應時間對SA、MS阻斷亞硝胺合成效果的影響

結果表明，SA、MS阻斷亞硝胺的反應速度較快，37 ℃水浴下反應1 h時就已達到最大阻斷率，此時SA、MS對亞硝胺的阻斷率即可分別達到54.84%、55.06%，延長反應時間阻斷率反而下降.本實驗選擇1 h作為反應時間.

圖2 不同pH值對亞硝胺合成阻斷效果的影響

2.5不同pH值對亞硝胺合成阻斷率的影響根據以上實驗結果，改變緩沖液的pH值，在25 mL比色管中均加入6.0 mL濃度為4 mmol/L的的樣品(SA、MS)溶液，按照1.2的方法，分別測試反應液在254 nm波長照射下對亞硝胺的阻斷率，結果見圖2.

圖3 不同反應溫度對SA、MS對亞硝胺合成阻斷作用的影響

結果顯示，SA、MS對亞硝胺合成的阻斷效果與pH值并不是簡單的線性關系，而是一個波動過程.pH ≥ 5.00時，SA、MS對亞硝胺的阻斷作用較差，尤其是SA，在pH 6.80時對亞硝胺的阻斷率幾乎為零.但在pH 3.00時SA、MS對亞硝胺的阻斷效果卻比較好，可分別達54.84%、55.06%.預示反應體系的pH 值直接影響二甲基亞硝胺的生成，pH 酸性體系有利于SA、MS阻斷亞硝胺的合成.

2.6反應溫度對亞硝胺合成阻斷率的影響根據以上實驗結果，改變體系的水浴溫度，在25 mL比色管中均加入6.0 mL濃度為4 mmol/L的的樣品(SA、MS)溶液，按照1.2的方法，分別測試反應液在254 nm波長照射下對亞硝胺的阻斷率，結果見圖3.

由圖3可以看出，在溫度較低或者較高的范圍內，SA、MS對亞硝胺的阻斷效果不是很明顯，而在人體正常溫度范圍(37 ℃左右)，卻有良好的阻斷效果，說明SA、MS在人體內可以有效地阻斷亞硝胺的合成.

2.7 SA、MS與Vc對亞硝胺阻斷率的比較已經有很多報道證明了Vc 具有抗氧化作用[8-9]，還有文獻報道Vc 對亞硝胺合成的阻斷率亦很強[10]，所以選擇Vc 為參照物，比較SA、MS的阻斷能力.

根據以上各影響因子的實驗結果，以254 nm紫外線為輻射源，用相同量的SA、MS與Vc 進行阻斷反應，計算各自的阻斷率并進行比較，結果見表3.

表4 SA、MS與Vc對亞硝胺阻斷率的比較

由表3可以看出，同等條件下的SA、MS對亞硝胺的阻斷能力比Vc弱些，其阻斷能力依次為Vc> MS> SA，說明SA、MS均具有較強的阻斷亞硝胺的能力.

3 結論與討論

SA、MS能有效阻斷亞硝胺的合成.在反應時間1 h、pH3.00、反應溫度37 ℃、反應濃度為1.28 mmol/L、紫外輻射波長254 nm的條件下，SA、MS對亞硝胺合成的阻斷效果最好，與同等條件下的Vc相比較，阻斷能力依次是：Vc> MS> SA.

SA、MS和Vc的結構如右：

一些植物體內天然存在SA、MS，它們是植物抗逆(抗病、抗蟲等)的信號分子.利用植物有效成分阻斷亞硝胺合成是防治癌癥的有效途徑之一；本研究對SA、MS可有效阻斷強致癌物—亞硝胺合成的功能研究結果，不僅進一步開拓了SA和MS生物活性功能，也為天然酚類化合物抗癌生物活性分子作用機制的闡釋提供了部分科學依據.

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