荊防敗毒顆粒治療雞新城疫的臨床試驗

王艷萍,董 林,沈志強,郭時金,張 穎,張志美,周春鳳

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院,山東濱州256600;2.山東綠都安特動物藥業有限公司,山東濱州256600)

目前對新城疫的防治采用雞新城疫病毒(NDV)疫苗接種,即能收到較好效果,但由于SPF蛋的缺乏,疫苗生產質量、疫苗運輸、保存條件和免疫程序的選擇、免疫抑制病的發生等因素的影響使NDV疫苗的應用受到一定的影響,尤其在雞新城疫發生時,防治效果不夠理想,使雞新城疫仍為危害養雞業的最大疫病之一[1]。為此,山東綠都安特動物藥業有限公司與山東省濱州畜牧獸醫研究院聯合研制了新獸藥制劑“荊防敗毒顆?！?為了驗證其臨床效果,我們進行了以下試驗。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 健康21日齡海藍灰公雛500只,隔離飼養,血清學檢驗ND母源抗體HI≤2。

1.2 藥物 試驗藥物：荊防敗毒顆粒(主要成分：胡薄荷酮、α-蒎烯、薄荷醇),批號 20071210,山東綠都安特動物藥業有限公司研制。

對照藥物：荊防敗毒散(主要成分：荊芥、防風、羌活、獨活、柴胡等),批號 20070424,山東綠都安特動物藥業有限公司生產。

1.3 毒株 NDV F 48 E8株 購于中國獸醫藥品監察所。

1.4 抗原及血清 雞抗F48E8亞型NDV陽性血清、F48 E8亞型NDV標準抗原均由山東省農業科學院畜牧獸醫研究所實驗室保存。

1.5 雞胚 9～11日齡SPF雞胚,購自山東省農業科學院畜牧獸醫研究所。

2 試驗方法

2.1 雞群分組與攻毒 將500只雞隨機分成10組,每組50只,編號并記錄每只雞的體重、生長發育。攻毒：無菌條件下,將F48E8株 NDV 105EID50 1 000倍稀釋,0.1 mL/只肌肉注射。

2.2 組別分類

第1～3組：藥物預防組(攻毒前3 d分別在飲水中添加“荊防敗毒顆?！?.2 g/d?只、0.8 g/d?只、0.5 g/d?只,連用 3 d)。

第4組：藥物預防對照組(攻毒前3 d分別在飼料中添加“荊防敗毒散”劑量為1 g/d?只,連用3 d)。

第5～7組：藥物治療組(攻毒并出現明顯癥狀后,以“荊防敗毒顆?！憋嬎委?劑量為2 g/d?只、1.5 g/d?只、0.8 g/d?只,連用5 d)。

第8組：藥物治療對照組(將攻毒出現明顯癥狀的雞以“荊防敗毒散”治之,2 g/d?只拌料,連用5 d)。

第9組：空白對照組(即不攻毒,不用藥組)。第10組：陽性對照組(即攻毒不用藥組)。

2.3 病料的采集與處理[2]該試驗共持續15 d,每天觀察雞的臨床表現,對各試驗組每天用棉拭子隨機采10只雞的咽喉及泄殖腔黏液,將蘸取黏液的棉拭子立即放入 Hank′s中,充分振蕩,使黏液分散,3 000 r/min離心15 min,取上清,用于接種雞胚。

對試驗過程中死亡的雞及試驗結束后存活的雞剖殺,采集心、肝、肺、脾、腎等臟器研磨后 2 000 r/min離心 15 min,取上清,接種雞胚。

2.4 病毒的增殖 取2.3處理的樣品各1 mL分別置于滅菌的2 mL離心管中,之后加入200μL雙抗,37℃感作1 h,再用0.45μm 的微孔濾膜過濾除去雜質,濾液接種9～11日齡SPF雞胚絨毛尿囊腔,0.2 mL/胚,每個樣品接3個胚,同時用生理鹽水代替病毒,接種同批雞胚作為陰性對照,37℃繼續孵化,每天照蛋2次并棄去24 h內死胚,無菌收取24～96 h內的雞胚尿囊液并觀察雞胚病變,采用微量血凝試驗(HA)測定其血凝效價。

2.5 1%雞紅細胞懸液的制備 采取健康公雞血液用2%枸櫞酸鈉鹽水抗凝,放入50 mL的錐形離心管中,加入5倍體積的PBS緩沖(p H值7.4),3 000 r/min離心10 min,吸去上清和淡黃色的白細胞層,5倍體積的PBS緩沖(pH值7.4),3 000 r/min離心5 min棄去上清;重復用PBS洗兩遍,重懸至終體積12 mL,放入15 mL有刻度的錐形離心管中;3 000 r/min離心10 min,估計沉淀細胞的體積,稀釋到大致所需濃度。

2.6 微量血凝試驗(HA) 具體操作步驟如下,在96孔“V”型微量血凝板的1～12孔均加入50μL生理鹽水。用微量移液器吸取50μL待檢抗原(即尿囊液)加入到第1孔,混勻。從第1孔吸取50μL抗原液加入第2孔,混勻后吸取50μL加入第3孔,如此進行倍比稀釋至第11孔,從第11孔吸取50μL棄之,第12孔加入50μL生理鹽水作為對照。每孔加入50μL 1%雞紅細胞懸液,在微量振蕩器上混勻,室溫下靜置20～30 min后觀察結果。

2.7 判定標準

2.7.1 臨床判定標準 輕者：癥狀出現時間較遲,精神沉郁,采食量略減(10～20分);輕微：排黃綠色糞便,采食、精神正常(30分);重者：癥狀出現時間早,昏睡,呆立不動或臥地不起,采食量減少或廢絕(100分)。剖檢存在以下癥狀,輕微：個別腺胃乳頭出血,肌胃局部點狀出血,腸道淋巴出血或腫脹,盲腸扁桃體腫脹;中等：乳頭間大片出血,肌胃出血,腸道出血,盲腸扁桃體出血;嚴重：乳頭間彌漫性出血,肌胃大面積出血,盲腸扁桃體壞死,泄殖腔彌漫性出血。

2.7.2 用藥5 d后判定標準 發?。涸囼炂陂g,出現雞新城疫(ND)臨床癥狀和/或尸體剖檢有ND特征病變者定為發病;死亡：試驗期間死亡,并出現ND臨床癥狀和/或尸體剖檢有ND特征病變者,判定為感染死亡;保護：試驗期間,預防組未死亡雞均定為保護;痊愈：受試雞精神、食欲、糞便均恢復正常;有效：除完全治愈的雞屬于有效外,經用藥精神好轉,食欲、糞便有所恢復,與對照組比較死亡時間顯著延長者,可判定有效;無效：受試雞用藥后精神、食欲、糞便未見好轉,甚至加重死亡。

3 結果與分析

3.1 發病及臨床防治效果與分析 見表1。

表1 荊防敗毒顆粒對雞人工感染ND的防治效果

攻毒后 24 h第 5、6、7、8、10組即排綠色糞便,72 h 第 5、6、7、8、10 組雞表現精神沉郁,食欲消失或廢絕,羽毛松亂無光澤,垂頭縮頸,翅膀下垂,冠和肉髯發紺,眼半閉或全閉,似昏睡狀態,排黃綠色或黃白色稀便,嗉囊脹滿,從病雞口中流出酸臭黏液。預防1、2、3、4組于 72 h出現明顯癥狀。

高、中、低劑量治療組治愈率分別為 90%、88%、72%,藥物對照治療組治愈率為70%,其中高劑量治療組與中劑量治療組之間差異不顯著(P＞0.05),中劑量治療組與低劑量治療組之間差異極顯著(P＜0.01),中劑量治療組與藥物對照治療組之間差異極顯著(P＜0.01);高、中、低劑量預防組保護率分別為90%、88%、76%,藥物對照預防組保護率為70%,其中高劑量預防組與中劑量預防組之間差異不顯著(P＞0.05),中劑量預防組與低劑量預防組之間差異顯著(P＜0.01、P＜0.05),中劑量預防組與藥物對照預防組之間差異極顯著(P＜0.01)。

3.2 血凝試驗結果與分析 于給藥后第1、2、3、7、10、11、14天采集各試驗組雞的咽喉及泄殖腔黏液,按2.4病毒增殖后取尿囊液用微量法血凝試驗(HA)測其血凝效價,結果見表2。

表2 給藥后檢測血凝(HA)效價(log2)的結果

結果顯示,荊防敗毒顆粒高劑量治療組第1天血凝效價為2.9±0.74、2～14 d為0;中劑量治療組第1天所測得的血凝效價均為2.9±2.60、第2天為2.4±0.84,第3～14天為0;低劑量治療組僅于給藥后前7 d均有血凝效價,且平均效價較高,8～14 d為0;而荊防敗毒散治療組與陽性對照組給藥后第1天的血凝效價分別為6.4±0.97、9.9±0.74,給藥后第10天的血凝效價為 6.9±0.74、8.3±0.68,一直持續較高水平。試驗結束后,采集各試驗組活雞的臟器經處理后雞胚,96 h后收取尿囊液測得的效價均為0。

3.3 給藥后1～14 d采集各試驗組雞咽喉及泄殖腔拭子的排毒情況。見表3。

表3 給藥后1～14 d采集各試驗組雞咽喉及泄殖腔拭子的排毒情況

4 結語

由以上結果可知,將荊防敗毒顆粒按1.5 g/d?只和0.8 g/d?只的劑量飲水給藥對雞新城疫有很好防治效果,為臨床防治非典型新城疫提供了方法。

[1] 王瑋.中藥抗雞新城疫的臨床試驗研究[J].山西農業(畜牧獸醫),2007,10(1)：21-22

[2] 祝艷華.金絲桃素新制劑在體內對 H9N2和H 5N1亞型禽流感病毒抑制作用的研究[D].蘭州：甘肅農業大學動物醫學院,蘭州畜牧與獸藥研究所,2006：25.