榮昌豬IFN-ω基因的克隆與序列分析

趙光偉,王 帆,趙春燕,楊曉偉

(1.西南大學榮昌校區動物醫學系,重慶 榮昌402460;2.南京農業大學動物醫學院,江蘇南京210095)

干擾素(IFN)是機體天然免疫防御系統中的一類細胞因子,是一類具有廣譜抗病毒、增強動物對各種疾病的免疫力等多種生物學功能的蛋白質。目前發現的豬干擾素包括 IFN-α、β、γ、δ、ω等[1],其中研究較熱的有IFN-α,IFN-γ,對 IFN-ω的研究鮮有報道。IFN-ω是由5個以上的相關功能基因編碼的[2],蛋白質家族中與IFN-α亞型之間同源性很高,天然的IFN-α常常是IFN-α與IFN-ω功能基因表達產物的混合體。目前臨床中廣泛使用的干擾素大多是利用基因工程技術表達出的單純IFN-α的蛋白,這與天然的IFN-α存在一定的差異,這可能是導致實際臨床使用時其效果相對較差的原因之一。榮昌豬是我國一個優良的地方品種,在川渝地區飼養存欄量很高。本試驗旨在對榮昌豬IFN-ω進行克隆,獲得目的基因,為進一步了解IFN-ω在榮昌豬抗感染、抗病毒免疫應答中的作用,提高榮昌豬的抗病能力以及豐富榮昌豬的基因資源做鋪墊,發展榮昌豬養殖業。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1月齡榮昌仔豬,購自重慶種豬場。

1.2 試劑 pMD18-T載體、T4連接酶、膠回收試劑盒、淋巴細胞分離液購自上海生工生物工程技術服務有限公司;Catrimox-14TM RNA提取試劑盒、禽源反轉錄酶(AMV-RT)、Taq酶、dNTP、RNA 酶抑制劑等購自TaKaRa公司,宿主菌JM109由本實驗室保存;其他試劑均為國產分析純。

1.3 榮昌豬外周血淋巴細胞(PBMC)的分離與培養 無菌采取健康榮昌豬血10 mL,分離淋巴細胞。將白細胞層移于另一試管,加等量RPMI 1 640液,2 000 r/min離心20 min,棄上清,沉淀物再加入等量RPMI 1 640液,同上離心3次,去上清;沉淀細胞用含10μg/mL ConA、100 mL/L小牛血清的RPMI 1 640培養液(含100μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)懸浮,取10μL細胞懸液計數,將細胞懸液稀釋至5×106/mL,置于細胞培養板中,5%CO2培養箱中37℃培養12 h。

1.4 榮昌豬總RNA的抽提 收集培養后的細胞,利用Catrimox-14 RNA提取試劑盒提取總RNA,操作方法嚴格按試劑盒使用說明書進行。提取的RNA保存于-80℃,備用。

1.5 引物設計 根據GenBank中已發表的野豬IFN-ω基因序列(EU797619),利用生物軟件設計如下一對引物：上游引物：ATGGCCTTTGTGTTCTCTC;下游引物：TCAGGATGACCCCAGGTCTA,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.6 榮昌豬 IFN-ω基因的體外擴增 反轉錄條件：采用 20μL反應體系,其中模板 RNA 5μL,dNTP Mixture 1μL,5×RT-PCR Buffer 4 μL,MMulv Reverse Transcriptuse 1μL,Rnase inhibitor 0.5μL,特異下游引物 1μL,Rnase Free H 2O 7.5μL。反應條件30℃min,42℃40 min,95℃5 min。PCR條件：采用50μL反應體系,其中模板5 μL,上、下游特異引物各1 μL,LA Taq DNA Polymerase 0.5μL,d NTP Mixture 1 μL,dd H2O 16.5 μL。PCR反應條件為：94℃預變性4 min,94℃30 s,54.6℃30 s,72℃50 s,35個循環,72℃延伸10 min。后1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物,并利用膠回收試劑盒回收特異的573 bp的DNA條帶。

1.7 擴增片段的克隆與重組子的鑒定 將PCR產物連接到p MD18-T載體,轉化大腸桿菌JM 109感受態細胞,通過藍白斑篩選,選取藍斑用小量提取法提取其質粒,進行PCR鑒定。

1.8 序列測定與分析 將初步鑒定的重組子質粒送寶生物工程(大連)有限公司測序。序列測定結果利用DNAStar軟件進行序列分析。

2 結果

2.1 榮昌豬IFN-ω基因的體外擴增結果 榮昌豬IFN-ω基因的RT-PCR結果如圖1所示,經瓊脂糖凝膠電泳,獲得大小為573 bp的目的條帶。

2.2 榮昌豬IFN-ω基因的測序結果(見圖2) 榮昌豬IFN-ω基因測序結果如圖 3所示,序列全長573 bp,含一個完整的開放閱讀框(ORF),共編碼191個氨基酸。

2.3 榮昌豬IFN-ω基因與其他動物IFN-ω基因同源性比較和進化樹分析(見圖3) 由圖3可知,榮昌豬IFN-ω基因與野豬的的同源性最高,為99.5%,而與其他動物IFN-ω基因的同源性較低,其中與牛、野馬、貓和人的同源性分別為66.0%,63.7%,47.6%,24.5%,由此可見,榮昌豬IFN-ω基因與野豬的進化關系最接近。

2.4 榮昌豬IFN-ω基因蛋白質二級結構的預測與抗原性分析見圖4。

由圖4可見,榮昌豬 IFN-ω基因具有 9個α螺旋,2個β折疊,10個轉角和8個無規則卷曲,說明其二級結構比較復雜。對其抗原性分析預測發現其抗原性強的氨基酸位點較多,主要集中在35～75,95～130,150～190三個區域中,而其非抗原性的氨基酸位點少并且強度也比較弱,由此說明,榮昌豬IFN-ω基因翻譯的蛋白具有良好的抗原性,極有可能增強榮昌豬的免疫力。對其進行疏水性分析發現,榮昌豬IFN-ω基因翻譯的蛋白疏水性不強,具有12個親水位點,其中有3個是強親水位點。

圖1 榮昌豬IFN-ω基因的RT-PCR

3 討論

榮昌豬原產于重慶榮昌和隆昌兩縣,由于其適應性強、雜交配合力好、遺傳性能穩定、瘦肉率較高、肉質優良、鬃白質好等優點,目前已經發展到全國除臺灣外的各個省市,產區每年向外提供仔豬達140萬頭以上[3],是我國養豬業推廣面積最大、最具有影響力的地方豬種之一。因此,對榮昌豬生物制品進行前期的研發是發展榮昌豬產業的必要保障。

本試驗通過RT-PCR技術,從榮昌豬血液淋巴細胞中成功擴增出一特異條帶,經序列測定,與GenBank上登載的野豬IFN-ω基因(EU797619)的同源性為99.5%,這證明已經成功克隆到榮昌豬IFN-ω基因。通過與其他物種的IFN-ω基因對比,表明與野豬的同源關系最為密切,與牛、野馬、貓和人的關系分別次之。進而對其翻譯蛋白的二級結構進行預測分析,發現IFN-ω蛋白具有較強的抗原性,主要集中在35～75,95～130,150～190三個區域中,這對于研究開發IFN-ω的生物制劑具有重要的指導意義。較強的抗原性通常具有較強的親水性,雖然其原因還不甚明了,但該基因也符合這一規律,榮昌豬IFN-ω基因翻譯的蛋白疏水性不強,具有12個親水位點,其中有3個是強親水位點。

干擾素是參與免疫調節的重要細胞因子,能夠全面的促進體液免疫和細胞免疫,在抗病毒,抗腫瘤和增強免疫力方面發揮著重要的作用[4]。目前,臨床生產中使用的干擾素多為利用基因工程表達的純IFN-α的蛋白,由于IFN-ω是天然 IFN-α的功能基因表達產物之一,因此臨床使用的干擾素與天然干擾素之間存在差異,這或許是臨床使用干擾素時效果較天然干擾素較差的原因之一,本試驗利用分子生物學技術將榮昌豬IFN-ω基因進行克隆,為開發研制其生物制劑奠定基礎,以期能夠提高干擾素的抗病效果。

[1] Lebon A,Toughd F.Links between innate and adap tive immunity via type I interferon[J].Current Opinion in Immunology,2002,14(4)：432-436.

[2] 李臣賓.IFN-ω的研究進展[J].國外醫學：免疫學分冊,2005,28(1)：7-9.

[3] 趙敏,張庭科,郝靜,等.榮昌豬的品種特性與發展現狀[J].中國牧業通訊,2009,22：32-34.

[4] Haller O,Kochs G,Weber F.Interferon,Mx,and viral countermeasures[J].Cy tokine and Growth Factor Reviews,2007,18(5)：425-433.