間接免疫熒光抗體法在APP疫苗保護效果評價中的初步應用

邵美麗,劉思國

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所,黑龍江哈爾濱150001;2.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱150030)

豬傳染性胸膜肺炎(PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的一種以肺的急性出血、壞死和慢性纖維素性胸膜肺炎為主要特征的高度接觸性呼吸道傳染病。該病可致各年齡段的豬只發生急性和慢性感染,最高死亡率可達 80%～100%[1]。自1957年首次報道本病以來,本病幾乎遍及世界所有養豬國家,且流行日趨嚴重,已成為世界性規模化養豬的重要疫病之一[2]。因此,研發高效、安全的APP疫苗成為預防和控制本病蔓延的根本。而在研發疫苗的保護效果評價方面,大多以動物的存活率、抗體的產生情況、臟器的損傷情況為評價指標[3-5]。但這些指標均不能直接反映疫苗對試驗動物靶器官抗原的清除情況,也不能直接體現靶器官抗原的分布情況。故本課題組采用間接免疫熒光抗體法對免疫攻毒后小鼠靶器官-肺臟中的APP抗原進行了定位,比較了滅活疫苗和重組亞單位疫苗對小鼠肺臟中APP抗原的清除能力。同時與各組小鼠的存活率及其肺臟的病理學變化進行相關性比較。該方法的應用不僅為跟蹤定位 APP抗原在動物體內的分布奠定基礎,同時為更加直接、深入評價疫苗的保護效果提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株 APP1型72-1株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所細菌病研究室提供。

1.2 實驗動物 7周齡雄性BALB/c小鼠,購自哈爾濱醫科大學第二醫院。

1.3 抗體 辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自Sigma公司,兔抗APP1型陽性血清由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所細菌病研究室提供。

1.4 疫苗 APP1型滅活疫苗和重組亞單位疫苗(重組蛋白rApx I+rApxⅡ+rApx III+rOMP)均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所細菌病研究室自行制備。

1.5 免疫攻毒及樣品采集 將小鼠分成對照組、滅活疫苗組和重組亞單位疫苗組,背部皮下多點注射,每2周免疫1次,共3次。3免1周后,采用5LD50劑量,通過滴鼻攻 APP1型菌。攻毒5 d后,將存活小鼠剖殺,分離肺臟,備用。

1.6 間接免疫熒光抗體法定位肺臟中 APP抗原 用冰凍切片機將冰凍好的肺臟組織切成4μm厚的薄片,并將其粘附于載玻片上。待其自然干燥。滴加預冷的丙酮固定5 min。用0.01 mol/L p H值7.4 PBS洗滌3次,自然干燥。滴加兔抗 APP1型菌的陽性血清(1∶40稀釋),同時以未免疫小鼠的血清作陰性對照。玻片置于濕盒中,37℃孵育45 min。用0.01 mol/L p H 值7.4 PBS沖洗后,在裝有0.01 mol/L p H值7.2 PBS液的3個缸內依次浸泡,每個缸浸泡5 min,期間不時振蕩幾次。玻片從玻缸取出后,用濾紙吸干,滴加FITC標記山羊抗兔IgG抗體(1∶100稀釋,且含0.01%伊文思藍)。將玻片置于濕盒中,37℃孵育45 min,洗滌3次。晾干后,用碳酸甘油封片,于熒光顯微鏡下觀察。

1.7 肺臟的病理組織切片的制備 將小鼠的肺臟,經10%緩沖液福爾馬林固定后,常規石蠟包埋、切片,蘇木精-伊紅染色,制備病理組織切片[6]。

2 結果

2.1 免疫攻毒后各組小鼠肺臟中 APP抗原的分布情況 熒光檢測顯示,對照組小鼠攻毒后,肺泡及其間質內呈現閃亮熒光團,且團塊較大、數量較多。滅活苗組也有熒光團出現,但亮度、大小明顯小于對照組,數量也明顯少于對照組。重組亞單位疫苗組則無明顯熒光團出現,只見微弱的散在的熒光點,具體見表1、中插彩版圖1。

表1 間接免疫熒光檢測結果

2.2 免疫攻毒后各組小鼠的存活情況 免疫攻毒后,對照組小鼠全部死亡。滅活疫苗組存活率為60%(6/10)。重組亞單位疫苗組存活率為90%(9/10)。

2.3 免疫攻毒后各組小鼠肺臟的病理學變化情況 剖檢顯示,對照組小鼠肺臟顏色發黑,且有嚴重出血、壞死,損傷面積達90%以上。滅活疫苗組小鼠肺臟有中度出血、壞死,損傷面積達25%～35%。重組亞單位疫苗組小鼠肺臟無明顯病變(見中插彩版圖2)。

病理組織學觀察發現,對照組小鼠肺臟有大量炎性細胞浸潤,出血嚴重,肺泡內漿液性、纖維素性滲出且伴有大量脫落的肺泡上皮細胞,肺泡膈細胞變性、壞死、核濃縮,大部分肺泡崩解而造成實變。滅活疫苗組有中度出血,氣管周圍有炎性細胞、灶狀浸潤。肺泡漿液性、纖維素性滲出、炎性細胞浸潤,且部分肺泡裂解,形成實變。重組亞單位疫苗組無明顯病變,只有血管周圍有輕度水腫,個別肺泡內有少量的漿液性滲出(見中插彩版圖3)。

3 討論

間接免疫熒光抗體法是免疫熒光技術中的一種。該方法通過熒光素標記二抗的結合,將信號進行放大,在一定程度上提高了檢測的靈敏度。因其直觀性強和操作簡便成為實驗室常用的細菌、病毒快速檢測及臨床疾病的快速診斷的手段。不僅如此,由于其能夠直觀地應用熒光顯微鏡觀察到抗原在組織器官內細胞水平的確切分布和定位,也成為研究病原致病機理的有效手段[7-9]。也正是基于這個原理,本研究嘗試將間接免疫熒光抗體法定位組織器官內的抗原與疫苗的保護效果結合起來,這不僅為間接免疫熒光抗體法的更廣泛應用提供依據,同時也為評價疫苗的保護效果提供新的思路。

本研究采用間接免疫熒光法定位了免疫攻毒后的各組小鼠肺臟中的APP。結果顯示,滅活疫苗組和重組亞單位疫苗組小鼠肺臟中熒光強度、數量均明顯弱于對照組。重組亞單位疫苗組的熒光強度又明顯弱于滅活疫苗組。這說明滅活疫苗和重組亞單位疫苗均對APP抗原起到了一定的清除和中和作用,且重組亞單位疫苗組對APP抗原的清除和中和能力最強。因此初步判定,重組亞單位疫苗的保護效果優于滅活疫苗組。將該判定結果與各組小鼠的存活率及其肺臟的病理學損傷進行相關性比較,發現它們三者具有一致性,即重組亞單位疫苗組和滅活疫苗組小鼠的存活率及其肺臟的病理學損傷均弱于對照組,且重組亞單位疫苗組小鼠的存活率及其肺臟的病理學損傷又明顯弱于滅活疫苗組。因此我們認為,通過間接免疫熒光定位法攻毒后小鼠肺臟中的APP抗原作為疫苗保護效果的一種評價手段是可行的。

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