雞IFN-γ與雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)3-1E抗原共表達(dá)DNA疫苗的免疫保護(hù)性研究

徐守振,潘保良

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東青島266109;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193)

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳球蟲(chóng)引起的一類細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)病,每年給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種克服了藥物防治出現(xiàn)的耐藥性和藥殘等缺點(diǎn),逐漸成為防治雞球蟲(chóng)病的研究熱點(diǎn)。目前,球蟲(chóng)DNA疫苗預(yù)防球蟲(chóng)病已獲得部分保護(hù)效果[1],許多學(xué)者試圖從優(yōu)化載體設(shè)計(jì)、采用有效接種途徑、使用分子佐劑等進(jìn)一步增強(qiáng)其免疫保護(hù)效果。雞干擾素-γ(IFN-γ)能夠抑制雞艾美耳球蟲(chóng)的發(fā)育,因此IFN-γ常同DNA疫苗共同免疫來(lái)增強(qiáng)免疫保護(hù)作用[2]。本試驗(yàn)構(gòu)建了融合有雞IFN-γ和E.tenella 3-1E抗原基因的雙價(jià)真核表達(dá)質(zhì)粒,研究IFN-γ的免疫增強(qiáng)作用,為E.tenella DNA疫苗的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡AA肉雞購(gòu)自北京華都肉雞有限公司。

1.2 蟲(chóng)株、菌株和質(zhì)粒 E.tenella GS株、pGEX-I(含雞IFN-γ基因)和p GEX-E(含 E.tenella GS株3-1E基因)為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存。真核表達(dá)載體proVAX、PK-15細(xì)胞為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Eco R I、Xho I、DNA連接試劑盒、DNA回收純化試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,購(gòu)自 GIBCO/BRL公司。EndoFree Plasmid Maxi Kit,購(gòu)自Qiagen公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(LipofectamineTM),購(gòu)自Invitrogen公司。兔抗重組蛋白IFN-γ/3-1E(rIE)抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)IFN-γ和3-1E序列及SOE-PCR引物設(shè)計(jì)原則,共設(shè)計(jì) 4條引物。P1：5′-CCGGAATTCCATACTGCAAGTAGTCTAATTC-3′(Eco R I),P7：5′-ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC GCAATTGCATCT-CCTCTG-3′,P8：5′-GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG ATGGGTGAAG-AGGCTGATAC-3′,P4：5′-CCGCTCGAGTTAGAAGCCGCCCTGGTACAG-3′(Xho I)。連接IFN-γ和3-1E的(GGGGS)315氨基酸的 linker1 序列為：5′-GGTGGAGGC GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-3′(引物斜體部分),所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 融合基因SOE-PCR擴(kuò)增 以pGEX-I為模板,用P1和 P7擴(kuò)增 IFN-γ-linker1片段,反應(yīng)總體積50μL：ddH 2O 35μL,10×Buffer 5μL,d NTP 4μL,模板3μL,引物各1μL,Pyrobest DNA 聚合酶1μL;反應(yīng)條件：94℃5 min,94℃ 1 min,58℃1min,72℃1min,72℃10 min,共30個(gè)循環(huán)。在相同反應(yīng)條件和體積下,以pGEX-E為模板,用P8和P4擴(kuò)增linker1-3-1E片段。純化回收的IFN-γ-linker1和linker1-3-1E片段各1μL用作模板,用P1和P4擴(kuò)增IFN-γ/3-1E融合基因,反應(yīng)總體積 50 μL：dd H2O 36 μL,10×Buffer 5μL,dNTP 4 μL,模板2μL,引物各1μL,Pyrobest DNA聚合酶1μL;反應(yīng)條件：94℃5 min,94℃1 min,50℃1 min,72℃1.5 min,5個(gè)循環(huán);94℃1 min,58℃1 min,72℃1.5 min,72℃延伸10 min,24個(gè)循環(huán)。

1.6 真核質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 IFN-γ/3-1E融合基因和p GEX-I、pGEX-E及proVAX分別用Eco RⅠ+XhoⅠ酶切,連接、轉(zhuǎn)化、PCR及酶切鑒定均按常規(guī)方法操作。陽(yáng)性克隆命名為prol、proE和prolE,同時(shí)測(cè)序。按轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)將無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒制備的 proI、proE、proIE和proVAX體外轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后第30小時(shí)用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)目的蛋白的瞬時(shí)表達(dá)情況,一抗為兔抗rIE融合蛋白抗體(1∶100),二抗為羊抗兔FITC標(biāo)記抗體(1∶200)。

1.7 免疫保護(hù)效果評(píng)估 1日齡AA肉雞養(yǎng)至5日齡時(shí)隨機(jī)分為非免疫非感染對(duì)照組、非免疫感染對(duì)照組、proVAX組、proI組、proE組和 proIE組,每組各 20只;7日齡首免50μg/只的 porVAX、proI、proE和proIE;14日齡加強(qiáng)免疫一次;21日齡稱重,經(jīng)口感染5×104個(gè)E.tenella GS株孢子化卵囊;30日齡雞只稱重、剖殺。選取糞便中卵囊排出量和雞體增重作為免疫保護(hù)評(píng)價(jià)指標(biāo)。平均增重=攻蟲(chóng)后第10天體重-攻蟲(chóng)時(shí)體重。收集感染后5～10 d的糞樣,計(jì)算糞便中卵囊排出量。

1.8 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件分析,比較各組間差異。

2 結(jié)果

2.1 融合基因的擴(kuò)增 用P1和 P7擴(kuò)增得到約450 bp的特異條帶(IFN-γ-linker1),用 P8和P4擴(kuò)增得到約500 bp的特異性條帶(linker1-3-1E),以IFN-γ-linker1和 linker1-3-1E 為模板,用 P1和 P4擴(kuò)增得到約1 000 bp的IFN-γ/3-1E融合基因特異條帶(見(jiàn)圖1)。

2.2 真核質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 Eco RⅠ+XhoⅠ對(duì)proI、proE和proIE雙酶切,分別釋放出435 bp、516 bp和996 bp的特異片段及2 900 bp的載體片段。PCR及測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證成功構(gòu)建了proI、proE和proIE重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,IFA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染proI、proE和proIE的PK-15細(xì)胞漿出現(xiàn)特異的黃綠色熒光,而轉(zhuǎn)染proVAX的無(wú)特異熒光,表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒均可在PK-15細(xì)胞中成功表達(dá)所攜帶的目的基因。

圖1 IFN-γ/3-1E融合基因的構(gòu)建

2.3 免疫保護(hù)效果 各組攻蟲(chóng)后均無(wú)死亡,攻蟲(chóng)對(duì)照組體重顯著下降,核酸疫苗組均可提高相對(duì)增重。proI組體重幾乎恢復(fù)到非感染對(duì)照組,顯著高于proE(P＜0.05)。proIE組相對(duì)增重略高于proI和proE組,但差異不顯著(見(jiàn)圖2)。proIE組與proE組和proI組相比卵囊排出量顯著下降(P＜0.05),proI組與proE組卵囊排出差異不顯著(P＞0.05)。proIE組卵囊排出量最低(5.6×108個(gè)),為攻蟲(chóng)對(duì)照組(16.2×108個(gè))的 34.6%(見(jiàn)圖3)。

圖2 DNA疫苗免疫后各組的增重情況

3 討論

艾美耳球蟲(chóng)3-1E抗原為雞艾美球蟲(chóng)子孢子與裂殖子階段的表面抗原,在E.tenella、E.acervulina和E.necatrix之間均有很高的同源性能夠誘導(dǎo)交叉保護(hù)[3],是一個(gè)很好的可用于預(yù)防球蟲(chóng)病田間感染的潛在保護(hù)性抗原。本研究也表明含E.tenella 3-1E的proE能顯著降低E.tenella攻蟲(chóng)感染后糞便中卵囊的排出量,抑制艾美耳球蟲(chóng)在體內(nèi)繁殖。

Min等(2001)研究了細(xì)胞因子對(duì)堆型艾美耳球蟲(chóng)DNA疫苗(pcDNA3-1E)免疫的增強(qiáng)效果,發(fā)現(xiàn)同時(shí)注射 IFN-γ,體內(nèi)球蟲(chóng)繁殖速度明顯減慢[4]。周建民等研究(2005)也發(fā)現(xiàn),同時(shí)免疫3-1E基因和雞IFN-γ基因DNA疫苗與單純的3-1E免疫能進(jìn)一步減少卵囊排出量[5]。本試驗(yàn)應(yīng)用SOE-PCR構(gòu)建了含E.tenella 3-1E和雞IFN-γ基因的proIE,proIE免疫后同proI和proE單純免疫相比,同源攻蟲(chóng)后能進(jìn)一步減少卵囊的排出和增加體重,獲得更強(qiáng)的免疫保護(hù)。這表明雞IFN-γ與3-1E抗原基因融合后具有協(xié)同作用,15個(gè)柔性氨基酸連接子確保3-1E和雞IFN-γ蛋白都能在體內(nèi)正確表達(dá)發(fā)揮各自功能,兩基因融合表達(dá)時(shí)他們各自的抗原表位不被覆蓋。本研究表明,雞IFN-γ以融合形式作為E.tenella 3-1E DNA疫苗的基因佐劑能夠增強(qiáng)其免疫保護(hù)效果,為進(jìn)一步研究其在控制雞球蟲(chóng)病上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1] 吳紹強(qiáng),蔣金書(shū),劉群,等.雞球蟲(chóng)疫苗研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,36(1)：1-5.

[2] Lillehoj H S,Ding X.Resistance to intestinal coccidiosis following DNA immunization with the cloned 3-1E Eimer ia gene plus IL-2,IL-15,and IFN-gamma[J].Avian Dis,2005,49：112-117﹒

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[4] Min W,Lillehoj H S,Burnside J,et al.Adjuvant effects of IL-1beta,IL-2,IL-8,IL-15,IFN-alpha,IFN-gamma TGF-beta and lymphotactin on DNA vaccination against Eimeria acervulina[J].Vaccine,2001,20：267-274 ﹒

[5] 周建民.雞球蟲(chóng)核酸疫苗的研究[D].北京︰中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2005﹒