P38 信號通路在Aβ 介導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷中的作用

徐 芳 魏桂榮

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是較常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙。AD 的病因尚未闡明,其病理學(xué)特征之一為β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積。Aβ 由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)經(jīng)剪切而成,主要包括Aβ1-40 和Aβ1-42。目前認(rèn)為,Aβ 對神經(jīng)元具有損傷作用,其主要作用的物質(zhì)為可溶性的Aβ 寡聚體[1],但Aβ 引起神經(jīng)元損傷的機(jī)制尚不明確。P38信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族重要組成部分,在全身性炎癥反應(yīng)、休克、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡、心血管疾病等方面具有重要作用,研究發(fā)現(xiàn)P38 信號通路參與某些神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的發(fā)病過程[2],但是其在AD 發(fā)病過程中的作用尚不清楚,本研究使用Aβ 處理PC12 細(xì)胞,建立體外AD 細(xì)胞模型,并在此模型基礎(chǔ)上觀察了P38 信號通路在Aβ 介導(dǎo)的細(xì)胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)細(xì)胞株由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物儲藏中心提供;DM EM 培養(yǎng)基購于美國GIBCO 公司;二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(M TT )、Aβ25-35 和SB203580 購自美國Sigma 公司;兔抗P38 抗體和磷酸化P38(pP38)抗體購自Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和Aβ 處理 PC12 細(xì)胞用DM EM 的培養(yǎng)基(含10%的小牛血清,2 mmol/ L L-谷氨酰胺),37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔48 h 傳代1 次,待細(xì)胞鋪滿80%左右傳代。實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的Aβ(濃度為10 ～30 mmol/L)處理PC12 細(xì)胞。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(lán)法(M T T)檢測細(xì)胞活力調(diào)整PC12 細(xì)胞密度約2x105/ml,每孔100 μl 接種到96 孔板中,在37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,分為對照組、Aβ 組和SB203580 預(yù)處理組,每組設(shè)4個(gè)復(fù) 孔, Aβ 組以不 同 濃 度的 Aβ25-35 處理,SB203580 預(yù)處理組在Aβ 處理前30 min 給予SB203580(20 μmol/L)。各組達(dá)到處理時(shí)間后每孔加M TT 10 μl,繼續(xù)孵育4 h,吸取培養(yǎng)基,每孔加100 μl DM SO,震蕩10 min,酶標(biāo)儀選用單吸收波長570 nm 檢測各孔光吸收值(A 值)。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A 值/對照組A值×100%。

1.2.3 免疫印跡法(Western blotting)檢測P38 通路活化 實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組、Aβ 組和SB203580 預(yù)處理組,SB203580 預(yù)處理組在Aβ 處理前30 min 給予SB203580(20 μmol/L);細(xì)胞處理后吸棄培養(yǎng)基,生理鹽水洗3 次, 轉(zhuǎn)移離心管中,800 r/min 離心5 min,同樣方法洗3 次,棄上液,加4x SDS 上樣緩沖液,沸水中水浴5 min,測蛋白濃度。20 μg 蛋白樣品用10%SDS-PAGE 分離后,350 mA 恒流濕法電轉(zhuǎn)移1 h 至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別用小鼠抗P38 和p-P38 抗體4 ℃孵育過夜,TBST 洗3 次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h,洗膜,化學(xué)發(fā)光,顯影,掃描,用總ERK1/2 蛋白條帶作參照, 凝膠分析系統(tǒng)分析P38 和p-P38 條帶灰度比值變化。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ 對PC12 細(xì)胞活力的影響

隨Aβ 濃度的增高,細(xì)胞活力逐漸下降(圖1)。10 mmol/L 、20 mmol/L 和30 mmol/L Aβ25-35 處理后細(xì)胞活力分別下降到對照組的(73.21 ±3.65)%、(52.84±4.91)%和(40.38±4.71)%,與對照組比較,P＜0.01。且4 個(gè)濃度的Aβ 處理組之間均有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 Aβ 對PC12 細(xì)胞P38 通路活化的影響

正常生長的神經(jīng)元樣PC12 細(xì)胞中存在P38 表達(dá),但p-P38 表達(dá)極少;Aβ 處理后P38 表達(dá)量無明顯變化,但是p-P38 隨著Aβ25-35 處理事件的延長表達(dá)量逐漸增高, 以P38 表達(dá)為參照, 計(jì)算P38 與p-P38 表達(dá)量的灰度比值,發(fā)現(xiàn)4 h 時(shí)p-P38 表達(dá)開始升高,12 h 達(dá)到高峰,并一直持續(xù)到24 h(圖2)。

圖1 Aβ 對PC12 細(xì)胞活力的影響與對照組比較, * P ＜0.05

圖2 Aβ 和SB203580 對P38 通路活化的影響

2.3 SB203580 對Aβ 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞活力下降和P38 通路的影響

SB203580 預(yù)處理能夠明顯抑制P38 通路的活化(圖2)。在20 umol/L 的濃度下SB203580 單獨(dú)處理對細(xì)胞活力沒有明顯影響,而SB203580 預(yù)處理能夠明顯減低Aβ 介導(dǎo)的細(xì)胞活力下降,細(xì)胞活力由(52.84±4.91)%上升到(75.32±5.23)%,與單獨(dú)Aβ 處理組比較,P＜0.05(圖3)。

圖3 Aβ 和SB203580 對PC12 細(xì)胞活化的影響與對照組比較, *P ＜0.05;與Aβ 組比較, #P ＜0.05

3 討 論

AD 是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病,其發(fā)病機(jī)制存在許多學(xué)說。AD 的神經(jīng)病理學(xué)特點(diǎn)為受損神經(jīng)元內(nèi)Aβ 異常聚集,而Aβ 是淀粉樣前體蛋白(APP)的異常酶切產(chǎn)物,而APP 基因突變也可導(dǎo)致AD 的發(fā)生,因此Aβ 毒性是AD 發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制[3]。既往研究發(fā)現(xiàn),Aβ 立體定位腦室內(nèi)注射能夠誘導(dǎo)動物出現(xiàn)癡呆[4]。但是,Aβ 導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的確切機(jī)制尚不明確。本研究選擇PC12 為研究對象,PC12 細(xì)胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤,能夠較好地模擬神經(jīng)元的某些特征,因此常用于神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病發(fā)病機(jī)制的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aβ 能劑量依賴性的誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞活力下降。因此本研究采用該模型進(jìn)行Aβ 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究。

P38 信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號通路,從屬于MAPK 信號通路。某些刺激因素通過一系列酶促級聯(lián)反應(yīng)激活MKKKK3 和M KK6 等分子,進(jìn)一步磷酸化P38 而激活P38 信號通路,這種級聯(lián)放大式的激活能夠?qū)⑿盘柗糯?同時(shí)還能夠在各個(gè)環(huán)節(jié)上調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)到過程。受P38 信號通路調(diào)控的細(xì)胞效應(yīng)包括細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥等[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)P38 信號通路是細(xì)胞正常功能所必需的信號通路,但也有研究發(fā)現(xiàn)P38 通路參與各種細(xì)胞損傷[6]。本研究發(fā)現(xiàn)Aβ 處理PC12 細(xì)胞后出現(xiàn)P38信號通路活化,而用其特異性抑制劑SB203580 預(yù)處理則能夠明顯抑制Aβ 介導(dǎo)的P38 信號通路活化和細(xì)胞損傷,因此說明P38 信號通路可能參與Aβ介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

P38 誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的確切機(jī)制尚不清楚,但既往研究發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞損傷因素如紫外線、高滲環(huán)境、細(xì)胞因子等都能夠激活P38 信號通路,P38 通過激活c-jun、c-fos,誘導(dǎo)Bax 轉(zhuǎn)位等機(jī)制進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷。另外,P38 通路參與細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié),而細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架異常也是AD 發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[7]。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)P38 信號通路參與Aβ誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷,抑制P38 信號通路可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。

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