大鼠兩種腦血管痙攣模型的早期腦損傷研究

范議方 韓如泉

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SA H)后腦血管痙攣(cerebral vasospasm, CVS)是一個災難性的病理生理狀態,是患者病情惡化、致殘和致死的重要因素[1]。細胞凋亡在CVS 所致腦損傷中有著重要作用,本研究采用枕大池一次注血及二次注血法復制大鼠蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣模型,觀察凋亡相關基因Bax 和Bcl-2 在大腦皮層及海馬組織中的表達,研究兩種模型的早期腦損傷程度。

1 材料與方法

1.1 材料和設備 TUNE L 試劑盒(購自Roche 公司),一抗Bax、Bcl-2(購自Santa C ruz 公司),免疫組化染色試劑盒PV-9002、濃縮型DAB 試劑盒ZLI-9032(購自北京中杉金橋生物技術有限公司);旋轉式切片機(Histostat 820,美國), 熒光顯微鏡(Nikon E600,日本),透射電子顯微鏡(Hitachi H-7650,日本)。

1.2 實驗分組 雄性Wistar 大鼠(8 ～9 周),體重300 g 左右,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,并隨機分為假手術組、枕大池一次注血組及二次注血組。

1.3 動物模型制備 10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后,備皮(頸枕手術區域及腹股溝區)。在腹股溝區剪開約1 cm 的切口,暴露股動脈并置入24G 套管針,用1 ml 注射器(管壁預先肝素抗凝)抽取0.3 ml 動脈血;大鼠改為俯臥位,于頸枕交界中線切開約1 cm 的切口,在交界區三角形凹陷處穿刺,回抽見腦脊液后緩慢(約2 min)注入動脈血,封閉縫合切口;隨即將大鼠置于頭低位30°約30 min,以利于血液廣泛分布于顱底蛛網膜下腔;一次注血組應用該方法于枕大池注血一次;二次注血組在一次注血后48 h 再次注血。

1.4 標本的留取 大鼠于手術后24 h 過量麻醉下開胸灌注取腦(灌注壓力100 cmH2O),首先將穿刺針置入心尖并固定,夾閉腹主動脈,剪開右心耳,灌注0.9%的生理鹽水(室溫),待流出液體清亮后注入4 ℃4%的多聚甲醛,大鼠上肢劇烈抽動即為灌流成功的標志;待上肢及頭頸部僵硬后即斷頭取腦;取出的腦組織置入4%的多聚甲醛中行后固定;24 h后切取腦片,常規脫水、石蠟包埋、組織切片(厚度為5 μm),行HE 染色觀察基底動脈組織結構并計算血管橫截面積;用于電鏡檢查的標本于灌注后取腦置于2%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液中固定并制成超薄切片后于透射電鏡下觀察。

1.5 基底動脈橫截面積測量 采用顯微鏡(Nikon E600)以及計算機圖像采集系統對3 組標本基底動脈進行觀察并拍片,應用圖像處理軟件(Image J 1.37)計算橫截面積。

1.6 免疫組化染色 按照試劑盒的說明書行免疫組化染色;PBS 代替一抗作為空白對照;分別對3 組標本大腦皮層及海馬腦組織Bax 及Bcl-2 的染色情況進行觀察并拍片;在每張切片的大腦皮層及海馬均分別隨機選取5 個視野并進行免疫反應評分(immunoreactivity score, IRS),由陽性細胞的百分數(percent of positive cells, PP)計分與染色強度(staining intensity , SI)計分相乘所得;PP 計分:0分, ＜1%,1 分,1%～25%,2 分,26%～50%,3 分,51%～75%,4 分, ＞75%;SI 計分:1 分,弱染色,2分準[,2中]。等染色,3 分,強染色,SI 計分以多數細胞為

1.7 統計學處理 采用SPSS 11.5對各組大鼠基底動脈的橫截面積、大腦皮層及海馬組織中Bax 及Bcl-2 的免疫反應評分行方差分析;結果以±s表示,P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠病死率 假手術組大鼠共20 只, 無死亡;一次注血組大鼠共26 只,死亡3 只,病死率為11.5%;二次注血組大鼠共29 只,死亡10 只,病死率為34.5%。

2.2 光鏡下基底動脈的橫截面積變化 SAH 后24 h 二次注血組的基底動脈橫截面積明顯小于假手術組(P＜0.01),略小于一次注血組,但差異無統計學意義(P＞0.05)(圖1)。

圖1 各組大鼠基底動脈橫截面積與假手術組比較, *P ＜0.01

2.3 電鏡下海馬組織超微形態學觀察 假手術組海馬神經元正常,細胞核大而圓,染色質呈細顆粒狀散在分布于核內;細胞質內可見到橢圓形、啞鈴形的線粒體,可見內膜、外膜以及排列整齊的線粒體嵴;一次注血組神經細胞核膜凹陷,核內染色質凝聚,線粒體嵴模糊不清,內質網輕度擴張,神經細胞外周有腫脹的星形細胞觸突包繞;少突膠質細胞核內染色質凝聚邊集,有些細胞胞膜消失;二次注血組神經細胞核膜凹陷,染色質固縮,線粒體嵴斷裂,內質網擴張,溶酶體增多,星形細胞觸突水腫,胞體腫脹,脂褐素增多,多聚核糖體部分解聚(圖2)。

圖2 大鼠海馬CA1 區神經元超微結構變化(×10 000倍)A 為假手術組;B 為一次注血組;C 為二次注血組

2.4 TUN EL 檢測細胞凋亡 假手術組T UNEL染色后大腦皮層及海馬神經細胞著色淺,陽性細胞少見,而注血組陽性細胞較數多,其中一次注血組與二次注血組與假手術組比較均有顯著性差異(P＜0.05,表1,圖3)。

表1 各組大鼠大腦皮層及海馬TUNEL 的IRS(±s, n=6)

表1 各組大鼠大腦皮層及海馬TUNEL 的IRS(±s, n=6)

注:與假手術組比較, #P ＜0.05, ##P ＜0.01

組別 大腦皮層 海馬假手術組 4.83±1.35 6.47±2.75一次注血組 9.07±1.15## 9.67±2.34#二次注血組 9.53±0.60## 10.67±1.23#

圖3 大鼠大腦皮層及海馬組織中的TUNEL 染色(×400倍), D 為皮層;E 為海馬;1、2、3 分別表示假手術組、一次注血組、二次注血組

2.5 Bax 、Bcl-2 在大腦皮層及海馬組織中的表達水平 枕大池一次注血組及二次注血組中Bax 在大腦皮層及海馬組織中的表達均較假手術組顯著增加(P＜0.01),但兩者間差異無顯著性(P＞0.01)。注血組Bcl-2 的表達均較假手術組顯著下降(P＜0.01),表2,圖4)。

表2 各組大鼠大腦皮層及海馬Bax、Bcl-2的IRS(±s, n=10)

表2 各組大鼠大腦皮層及海馬Bax、Bcl-2的IRS(±s, n=10)

注:與假手術組比較, #P＜0.01

組別大腦皮層 海馬Bax 的IRS Bcl-2 的IRS Bax 的IRS Bcl-2 的IRS假手術組 0.59±0.30 1.64±0.31 0.56±0.26 1.17±0.51一次注血組 1.43±0.43# 0.42±0.29# 1.13±0.48# 0.24±0.29 #二次注血組 1.75±0.37# 0.24±0.14# 1.16±0.45# 0.10±0.08 #

3 討 論

圖4 F1-3、G1-3 分別表示Bax 在假手術組、一次注血組、二次注血組大鼠大腦皮層及海馬組織中的免疫組化染色;H1-3、I1-3 分別為Bcl-2 在3 組大鼠大腦皮層及海馬組織中的免疫組化染色(×400 倍)

SA H 是臨床上較為常見的腦卒中類型,在中國每年每10萬人中約有2 人發生SAH[3],發病初期致死率約為40%,30%的幸存者會有神經和認知功能障礙。SAH 后由于急性顱內壓增高和蛛網膜下腔沉積的血塊可造成腦血流的急劇降低,如不能得到及時治療,將不可避免地發生急性全腦缺血,幸存者會造成記憶與認知功能障礙[4]。

在選取SAH 后24 h 這一實驗點進行研究后發現,一次注血組及二次注血組的大鼠基底動脈橫截面積均較假手術組減小,說明一次注血后24 h 及二次注血后24 h 大鼠的基底動脈均發生了痙攣,但程度不一,二次注血后似更為嚴重。另外,注血組基底動脈亦出現了如血管內膜增厚、皺褶、細胞層數增多等病理變化,CVS 在SAH 后早期即可出現,其所致的早期腦損傷(Early brain injury, EBI)不容忽視。有學者認為EBI 可能是SAH 患者病死率較高的首要原因[5]。Zhang 等指出EBI 是SAH 早期致死致殘的主要原因。其中神經細胞和血管內皮細胞的凋亡起了重要作用[6]。本研究結果表明,注血組大腦皮層及海馬凋亡陽性細胞數顯著增多。

細胞凋亡受多種凋亡相關基因及其蛋白的調腔。Bcl-2 家族在細胞凋亡調控中起著重要作用,主要包括兩類:一類抑制細胞凋亡,如Bcl-2、Bcl-X(L)等;另一類促進細胞調亡,如Bax、Bid、Bad 等。Bax是促凋亡蛋白,通過激活一系列下游基因發揮促凋亡作用,Bcl-2 蛋白通過抑制細胞色素C 釋放,而抑制酶聯反應而保護細胞凋亡[7]。Bcl-2 及Bax 的相對比值在決定細胞生存或死亡中可能起關鍵作用[8]。正常情況下Bcl-2/Bax 保持一定比例,若Bax 增加,Bcl-2/Bax 比值降低,則促進細胞凋亡;相反,若Bcl-2 增多,Bcl-2/Bax 比值增大,則抑制細胞凋亡。本研究中注血組Bax 表達水平均較假手術組高, 而Bcl-2 表達水平較假手術組低,說明注血組大鼠腦組織出現較嚴重細胞凋亡,而二次注血組凋亡細胞數更多,但這是否說明二次注血組大鼠的腦損傷程度更重尚需進一步研究。

通過實驗發現注血后24 h 即可出現細胞的凋亡,其又可能是引起早期腦損傷的重要因素,因此干預細胞凋亡,阻止其進一步發展可能是減輕腦損傷的關鍵,這也為臨床治療SAH 后早期腦損傷提供了新思路。

1 張治元,史繼新.動脈瘤性蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的治療進展.中華神經外科雜志,2009,25(5):477-479.

2 Friedrich M, Villena-H einsen C, Reitnauek K, et al.Malignancies of the uterine corpus and immunoreactivity score of the DNA‘mismatch-repair' enzyme hum an Mut-S-homologon-2.Histochem Cytochem , 1999, 47(1):113-118.

3 Bederson JB, C onnolly ES Jr.Batjer H H, et al.Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage a statement for healthcare professionals from a special w riting group of the stroke council, American heart association.Stroke, 2009, 40(3):994-1025.

4 Sehba FA, Bederson JB.Mechanism s of acute brain injury after subarachnoid hemorrhage.Neurol Res, 2006, 28(4):381-398.

5 郭宗鐸,孫曉川,林 斌,等.蛛網膜下腔出血后早期海馬MMP-9的表達與海馬神經元凋亡的相關性研究.第三軍醫大學學報,2009,31(1):71-74.

6 Park S, Yamaguchi M, Zhang JH, et al.Neurovascular protection reduces early brain injury after subarachnoid hemorrhage.Stroke, 2004, 35(10):2412-2417.

7 蔣顯鋒,師睿蔚,王睿智,等.神經生長因子對氧合血紅蛋白誘導鼠神經細胞凋亡的作用研究.中華神經外科雜志,2008, 24(12):940-943.

8 吳有志,徐善水.細胞凋亡及其基因調控在腦血管痙攣中的研究.醫學綜述,2006,12(23):1426-1428.