HPLC法測(cè)定齒囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物中麥角甾醇含量

魏文培等

[摘要]目的 建立齒囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物中麥角甾醇含量的測(cè)定方法。 方法 采用高效液相色譜方法，漢邦ODS-C18色譜分析柱（250×4.6mm，5?m），流動(dòng)相為100% 甲醇，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長282nm；柱溫30℃。 結(jié)果 麥角甾醇進(jìn)樣量在0.20～1.40μg之間與吸收峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999；平均加樣回收率為100.07%，RSD（%）=1.91%。方法具有較高的專屬性、準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和可行性。 結(jié)論 該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度好，為齒囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了可靠依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]齒囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物；麥角甾醇；高效液相色譜

[中圖分類號(hào)] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）01-89-03

[Abstract] Objective To establish a method for determination of ergosterol content in irpex lacteus sac fungi solid fermentation products. Methods Using high performance liquid chromatography， Hanbond ODS-C18 column chromatography （250×4.6mm， 5μm）， the mobile phase of 100% methanol， flow rate was 1.0mL/ min， detection wavelength was 282nm； column temperature was 30℃. Results The injection volume of ergosterol was between 0.20-1.40μg absorption peak area， showed a good linear relationship， r=0.9999； the average recovery was 100.07%， RSD（%）=1.91%. The method had a high specificity， accuracy， reproducibility and feasibility. Conclusion The method is simple， accurate， sensitive， good， it provides a reliable basis for quality evaluation of irpex lacteus sac fungi solid fermentation product.

[Key words] Irpex lacteus sac fungi solid fermentation products； Ergosterol； HPLC

我國食藥用真菌資源豐富且使用歷史悠久，在民間和臨床都有較為廣泛的應(yīng)用，其開發(fā)與利用的潛力巨大。齒囊耙齒菌Irpex hydnoides Y.W.Lim & H.S.Jung [1] 隸屬于非菌目多孔菌科耙齒菌屬真菌，民間用來治療腎小球腎炎和痛風(fēng)等疾病。主要分布于吉林省長白山區(qū) [2]。

齒囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物是齒囊耙齒菌絲體與薏苡米雙向發(fā)酵的產(chǎn)物。薏苡米仁別名米仁、六谷、川谷、菩提子，來源為禾本科植物薏苡的種仁。臨床可治療多種惡性腫瘤，多配入復(fù)方使用，在辨病與辨證相結(jié)合的基礎(chǔ)上，與其他抗腫瘤藥組成復(fù)方應(yīng)用[3]；還可治療肥胖癥、急性咽喉炎、皮膚科疾病[4]等。齒囊耙齒菌自然界中存量較少，故采用生物工程固體雙向發(fā)酵技術(shù)，以薏苡仁為培養(yǎng)基得到齒囊耙齒菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物，替代野生的齒囊耙齒菌

子實(shí)體作為藥用?？梢杂行У慕鉀Q菌體野生資源匱乏，液體培養(yǎng)成本較高等諸多開發(fā)利用上的瓶頸問題。對(duì)食藥用真菌生物資源合理有效的利用以及開發(fā)開辟了新的道路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑

齒囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥用真菌研究室提供。麥角甾醇對(duì)照品（上海田源生物技術(shù)有限公司）；甲醇為色譜醇（美國Fisher公司）。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）。AUY220精密電子天平，（日本島津公司生產(chǎn)），TGL16M臺(tái)式高速冷凍離機(jī)（湖南凱大科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取齒囊耙齒菌固體發(fā)酵物2g，加入10mL甲醇，用封口膜封口，稱重。超聲提取30min，再次稱重，加入甲醇至提取前重量。2500r/min離心15min，取上清液，用0.45μm脂溶性濾膜過濾，即得供試品樣。

2.3 色譜條件[5-10]

漢邦ODS-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長282nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL，理論塔板數(shù)以對(duì)照品峰計(jì)不得少于3000。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取對(duì)照品溶液2， 6，10，12，14μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定吸收峰面積。分別為217.449，748.580，1268.122，1527.775，1783.282。以麥角甾醇質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，吸收峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=1243.6X-37.7，r=0.9999，表明其在0.20～1.4μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度考察 取對(duì)照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定，重復(fù)5次。峰面積分為472.396，473.192，473.671，472.132，473.462。RSD%=0.142%，表明儀器精密度良好

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，分別于0，6，10，16，32，48h注入高效液相色譜儀，每次進(jìn)樣量為10μL，依法測(cè)定。吸收峰面積分別為472.496，473.122，472.344，472.334，474.001，473.829，RSD（%）=0.159%， 結(jié)果表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性考察 精密稱取同一批齒囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物供試品共6份，按照供試品溶液的制備方法制備，分別注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量為10μL，測(cè)定吸收峰面積值。分別為473.156，472.699，473.798，472.164，473.999，474.102；RSD（%）=0.165%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率考察 精密稱取已知麥角甾醇含量的齒囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物供試品共6份，按供試品制備方法制備，依法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1 。

RSD值為1.91%，證明此方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高，并且操作簡單。

2.5 樣品含量測(cè)定

取齒囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得吸收峰面積分別為473.397，473.310，474.18，代入回歸方程計(jì)算，麥角甾醇的平均含量為0.021%。

3 討論

麥角甾醇是真菌類的特征化合物，是真菌細(xì)胞膜的重要組成部分，對(duì)確保細(xì)胞膜的完整性，膜結(jié)合酶的活性，膜的流動(dòng)性，細(xì)胞活力以及細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)绕鹬匾饔?。麥角甾醇受到紫外線照射時(shí)可轉(zhuǎn)化為維生素D2，是維生素D2的前體，也是生產(chǎn)甾體激素藥物的重要原料，可用來生產(chǎn)黃體酮和可的松等。高虹等[11-12]采用小鼠S180移植瘤實(shí)驗(yàn)研究了巴西菇子實(shí)體中麥角甾醇的體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果表明，巴西菇子實(shí)體中提取的麥角甾醇有較強(qiáng)的抑瘤活性，能夠強(qiáng)烈地抑制腫瘤血管生長。因此，測(cè)定齒囊耙齒菌中麥角甾醇含量為今后研究開發(fā)其甾體激素藥物和抗腫瘤功效具有一定的指導(dǎo)作用。

鑒于麥角甾醇是真菌生物膜的主要成分，因此其含量也將成為齒囊耙齒菌液體和固體發(fā)酵生物量的重要標(biāo)志物之一。采用高效液相色譜法測(cè)定其固體發(fā)酵產(chǎn)物中的含量，可有效監(jiān)控發(fā)酵產(chǎn)物中齒囊耙齒菌菌絲的生成量，保證發(fā)酵物的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)建立的該方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高，操作簡單。在流動(dòng)相為甲醇，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長282nm，理論塔板數(shù)以麥角甾醇峰計(jì)不得少于3000條件下，麥角甾醇在0.20～1.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣平均回收率為100.07%，RSD值為1.91%?？蔀辇X囊耙齒菌固體發(fā)酵產(chǎn)物中麥角甾醇的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 戴玉成.中國多孔菌名錄[J].菌物學(xué)報(bào)，2009，28（3）：320.

[2] 李茹光.吉林省真菌志[M].長春：東北師范大學(xué)出版社，1991：133.

[3] 范世忠.藥食兼用薏苡仁[J].藥膳食療，2005，5（1）：39.

[4] 劉茜.薏苡仁臨床藥用舉隅[J].中國臨床醫(yī)師，2002，30（4）：59.

[5] 張方英，方保梅，張靜.靈芝制品中麥角甾醇的檢測(cè)方法[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，19（1）：22.

[6] 張麗，王瑜杰，丁安偉.HPLC法測(cè)定靈芝孢子油中麥角甾醇的含量[J].江蘇中藥，2009，41（6）：52-53.

[7] 高杰，周賢，宋欣，等.HPLC法測(cè)定蜜環(huán)菌中麥角甾醇含量測(cè)定[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3（2）：104-105.

[8] 高杰，周賢，宋欣，等.HPLC法測(cè)定花菇中麥角甾醇含量測(cè)定[J].食用菌，2013（2）：64-65.

[9] 谷學(xué)新，趙紅帥，鄒洪，等.高效液相色譜法測(cè)定功能性紅曲米粉中的麥角甾醇[J].首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006（1）：78-79.

[10] 李思明，馮怡，曾星.HPLC-APCI-MS/MS法同時(shí)測(cè)定豬苓顆粒中麥角甾酮與麥角甾醇的含量[J].藥物分析雜志，2014，34（4）：649-653.

[11] 高虹，谷文英，丁霄霖.巴西蘑菇菌絲體中抑瘤活性甾醇的分離和結(jié)構(gòu)鑒定[J].食品研究與開發(fā)，2006（6）：52-54.

[12] 高虹，谷文英，丁霄霖.巴西蘑菇發(fā)酵菌絲體醇提物的抑瘤活性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006（6）：54-57.

（收稿日期：2014-10-11）