固態發酵中的傳感器檢測技術

楊佐毅,李 理

(1.廣東工業大學環境科學與工程學院,廣東廣州 510006; 2.華南理工大學食物蛋白工程研究中心,廣東廣州 510640)

固態發酵中的傳感器檢測技術

楊佐毅1,李 理2

(1.廣東工業大學環境科學與工程學院,廣東廣州 510006; 2.華南理工大學食物蛋白工程研究中心,廣東廣州 510640)

固態發酵(SSF)中各種變量的檢測對發酵過程的控制具有重要意義,但由于其培養基來源的多樣和復雜性,使得這些參數不易測定。本文綜述了固態發酵中采用不同傳感器對環境參數 (溫度、pH、水分含量和水活度)和碳素平衡(生物量、底物濃度、CO2)的檢測方法,并對目前固態發酵在線檢測中的新技術應用,以及具有應用潛力的檢測方法(X射線、磁共振成像技術等)進行了介紹。

固態發酵,傳感器,在線檢測

1 環境變量的檢測

1.1 溫度測定

在固態發酵中溫度與濕度范圍的監控至關重要,例如在堆肥生產中,溫度達到 80℃時會成為限制因素而造成曝曬,導致培養基干燥和水活度下降并使養分流失。溫度測定中常用的傳感器包括熱電偶、熱敏電阻或金屬探針 Pt100(表1),溫度傳感器一般置于反應器徑向的不同距離并連接到相應的控制系統,通常在氣流入口和出口測定固態發酵生物反應器內的溫度情況。在實驗室條件下可通過控制恒溫水浴或室內溫度來調節固態發酵反應器的溫度,而在工業規模生產中,通過強制通風、攪拌或蒸汽加熱來進行溫度控制,最有效的方法是調節進入反應器的空氣濕度,誤差為 ±4℃。

1.2 水分含量與水活度的測定

水分含量通常采用離線測定干重進行分析,但這種方法不能準確測定微生物生長代謝活動所消耗的水分。SSF中的水活度 (aw)測定可采用細胞接觸平衡法 (The Prox imity Equilibration Cell method)[2],采用干燥的濾紙或微晶纖維素與培養基質接觸,通過測定其重量的變化可測得水活度變化,雖然不能在線檢測但可實現水分測定的自動化。在線測定中使用最多的是用電容式傳感器來測定水活度 (aw)和空氣濕度。在實驗室研究中可將生物反應器置于室內,用飽和鹽溶液調節空氣濕度從而來控制 SSF的水活度,而大規模生產中常用飽和濕空氣通風來進行控制。

表 1 不同溫度傳感技術的比較[1]

表 2 離線生物量測定[1]

1.3 pH

pH是衡量微生物代謝活性變化的指標,其變化會影響基質消耗 (如蛋白質水解)與代謝物 (例如有機酸)的產生,在 SSF中可通過在冷卻水中加酸堿進行 pH控制。由于 SSF中缺乏游離水,因此無法用電極直接測定固體培養基的 pH。有些研究人員將樣品浸泡于蒸餾水中,然后采用電位電極或 pH電極來測定,但這樣難于精確控制固態培養基的 pH[3],而標準的 pH測定方法是采用氮源物質 (尿素,氨鹽)、鈣鹽或堿性溶液等對培養基進行緩沖后進行測定。

2 碳平衡中變量的測定

在固態發酵中碳源在需氧條件下可轉化成生物量、代謝產物、CO2和水。微生物生長的在線監測可通過O2消耗和 CO2的產生(呼吸作用),以及絲狀真菌菌絲體生長引起的壓力降 (PD)等間接方法來測定,呼吸作用和 PD測量需要對空氣流量進行準確測量和控制。為了獲得有價值的數據必須進行離線檢測,通常需要從基質中取出生物量、蛋白質、核酸、麥角固醇和測定酶活力等特征成分(表 2),這些操作會影響物質平衡,從而對發酵具有破壞性。

2.1 氣流監測與控制

通常空氣流量是在反應器出口處采用測定裝置進行在線檢測,可采用的設備包括轉子流量計、熱式質量流量計、風力計或空速計等壓力傳感器,若采用可校準的電磁閥系統來監測出口的氣體流量,則可設定間隔為 100mL/min的進氣量進行數字化控制。

2.2 呼吸作用

由于O2在水中的溶解度低,因此也可在反應器頂部空間采用順磁分析儀測定濃度。順磁分析儀的缺點是對熱敏感和精度不高,但也足以檢測到氣體成分的變化和O2在反應器中的變化,由于順磁性的測量是非破壞性的,因此在其后可以連接紅外探測器來同時測定 CO2的含量。順磁分析很適合 SSF,因為在發酵過程中 O2是唯一的順磁性氣體。而液相中 O2濃度一般采用安培計探頭進行檢測。通常用紅外光譜來測定CO2,在分析中CO2的測量可用于評價固態基質的生物可降解性或研究揮發性有機物(VOC)的特點。CO2的釋放量也可先用NaOH、KOH等堿液吸收,然后采用手動或自動的方法檢測其含量。通過對呼吸作用的監控可評估微生物的生長、驗證氣體擴散模型,以及監測固態發酵生產。

采用氣相色譜(GC)可同時進行O2和 CO2的測定。利用兩個同心的色譜柱,其中一根柱充滿多孔聚合物或硅膠,從空氣中分離出 CO2;另一根柱充滿了一種分子篩對O2和N2進行分離,然后再用熱定量探測儀或導熱析氣計確定[4]。這一系統可同時在線監控幾個生物反應器,甚至在較大范圍內也能測定耗氧率的變化。測得數據可用于二氧化碳產率(CDPR)、呼吸商(RQ)、CO2產生和O2消耗率的計算,以及建立 O2攝取速率(OUR)基礎上的動態生長模型等。

表 3 氣味傳感器在固態發酵的應用

2.3 壓差測量

由于 SSF中微生物吸附在固體基質顆粒上和培養基的異質性,因此難以用生物傳感器進行檢測。生物量的增長可以直接測定菌絲的生長,采用這種方法需要在反應器中將氣體流速降到最低,而氣體流速可用壓差計、液柱或不同類型的壓力傳感器進行測定。PD/L值是壓力降和反應器長度的比值,可顯示發芽、生長、產孢等過程的定量變化,并反映了固定床的生產能力。由于在固態發酵中,植物性原料往往同時用來作為支持物和反應基質成分,滲透率變化不僅可能導致生物量增長,而且改變了固態反應器內部支持物的結構。因此壓力傳感器最好用作報警用,用于探測床層壓實性或排水性是否良好。

3 生物量和代謝產物的測定

氣體成分測定、近紅外(N I R)分光法和成像分析技術可用于測定生物量和代謝物的生長,有望在固態發酵代謝物生產的在線監控系統中得到應用。

3.1 揮發性有機化合物(VOC s)的分析

在固態發酵過程中往往會產生揮發性有機物,例如初級代謝產生的乙醇和堆肥中產生的次級代謝產物,這些代謝物質的量是微生物活性的重要指標。自上世紀九十年代中期開始,氣味傳感器 (電子鼻)在食品工業中得到商業化應用,用于監測產品的缺陷和異常情況[5]。氣味傳感器系統內設有敏感物質感應單元和數據處理單元,相應敏感材料可吸附和處理VOCs,通過傳感器測得的數據可對樣品進行分析。在固態發酵中氣味傳感器用來監測微生物增長,預測芳香族代謝物的質量,或在某些情況下可區別不同的微生物種類。在固態發酵監測中使用的感應元件包括半導體探測器 (如 SnO2)、導電聚合物和石英微感應器(表 3)。

雖然看起來頗具吸引力,但這些傳感器一般都存在重復性差、靈敏性差、選擇性差和反應時間滯后等弱點,生產中可將幾個傳感器結合使用來彌補各自的缺點。新的檢測技術如微型和低成本的氣相色譜法(GCs)可進行快速和可靠的氣味分析,已進入商業化應用,利用熱導率探測器可 3min內得出結果。質譜儀也可作為電子鼻使用,其優點在于選擇性、敏感性和適應性很好,GC-MS方法常被用于揮發性成分的定性和定量測定。田懷香等采用自制簡易的氣體吸取裝置,用 GC-MS對頂空固相微萃取法提取的金華火腿的風味物質進行測定,同時進行感官評價,對其中 22種化合物進行了明確的定性[6]。Hau采用GC-MS分析方法測定了自制和商品腐乳中的揮發性物質,其中的主要成分為醇和酯[7]。

3.2 紅外光譜

紅外光譜包括特征分子鍵的近紅外 (N I R)和中紅外 (M I R)吸收光譜。N I R和 M I R技術在固態發酵、堆肥和土壤有機物的分析中得到大量應用,例如在 SSF中采用 N I R(1100～2500nm和 800～1100nm)進行干酪風味成分的分析[8-9]。研究人員采用近紅外光譜和聲化學計量法來檢測玉米青貯法生產的沼氣,在靠近反應器的附近取樣,采用在線近紅外技術,標準差分析結果表明在線測定效果較好[10]。

3.3 人工視覺

人工視覺技術包括產品影像收集和相關特征的提取,需要進行攝像 (CCD)、數碼化和計算機處理(圖像分析),其中最困難的步驟在于建立從背景中自動分離目標對象的算法。在液體介質中由于微生物對均勻背景的對比度高,因此很容易進行圖像分離,可對酵母和菌絲的生長過程進行研究。而在固態發酵中,反應物的多樣性使得很難找到從背景中分離目標微生物圖像的方法。在土壤研究中,圖像分析可以用來鑒別培養基的宏觀結構 (體積、粒子大小和孔隙度)或菌絲生長。近年來 CCD在固態發酵中的應用正在逐漸增加,可使研究人員測量環境條件在真菌生理活動中的作用。

采用新的多光譜攝像技術在可見光范圍之外能夠拍攝菌絲,并且能對代謝產物或菌絲活動進行定量研究。紅外線和紫外線輻射范圍內,可以提高生物量和基質的反差,或者使得某些代謝物變得可見。例如某些真菌代謝物熒光染色后在紫外線照射下會成像,采用UV多光譜分析法還可區分不同菌株。

4 基于斷層攝影的檢測技術

由于固態發酵中培養基成分多樣,代謝中空間變量的數據也在不斷變化,因此可設計和利用傳感器來進行 X射線斷層攝影從而對 SSF的過程進行深入研究。例如固體培養基中的水分、生物量或代謝化合物的三維圖像,尤其是水分含量在固態發酵控制是一個關鍵的參數,在固態發酵以及食品、土壤領域的研究中,可利用微波、X射線和磁共振成像(MR I)等技術來研究水分的動態變化。

4.1 微波

微波感應傳感器的原理是建立在水分子吸收微波輻射的基礎上,其優點是對 SSF沒有破壞性,并可以測定出總的濕度值。例如在食品工業中,基于朗伯-比耳定律信號減弱的原理,微波傳感器正在應用于工業規模的生產,能檢測谷物、魚、面粉中的水分含量而對產品無破壞作用[11]。微波傳感器也用于分析土壤結構、溫度和鹽濃度等方面的內容。Pablo Resa等采用超聲技術來在線監控樣品中啤酒酵母細胞胞外水解酶的動態變化,具有檢測快捷方便、無污染、低消耗、非破壞性、分析速度快等優點[12]。采用微波傳感器是適應固體發酵的發展方向,但目前還較少用于對 SSF水分概況的分析。

4.2 X射線和伽馬射線

計算機輔助 X射線斷層攝影 (CT)是一種無破壞性的技術,目前使用在醫療領域,可對目標的內部特征進行觀察,實際上首先觀察到的是“片狀”的目標,然后將這些“片段”重新整合得到三維圖像,在土壤研究中,可采用 X射線技術可用于測量其多孔性與水分特征曲線[13]。在固態發酵的實驗室研究中,也可采用該技術來觀察菌絲的空間結構。

4.3 時間域-核磁共振(TD-NMR)

T D-NMR通常用于檢測食品中含1H的化合物或監測其在生產過程中的變化,這種技術可對固態培養基中的化學鍵和游離水進行測定,因此在 SSF培養基中,可應用該技術來進行濕度和水活度的分析。磁共振成像 (MR I)已被用于研究水的流動性、多孔介質中自由水和結合水等領域。

在固態發酵中,1H MR I技術用來測定水含量、葡萄糖的濃度梯度、固態基質中的水活度等,結果表明基質表面之下的水活度主要受到水含量的影響,而同一位置的葡萄糖濃度卻很低,可能是由于真菌菌絲層對葡萄糖的攝取率較高[14];MR I可用于固態發酵的研究,例如考查奶酪成熟過程中水分的變化[15],但由于磁共振成像儀還十分昂貴,目前其工業規模的應用還受到制約。

5 結語

固態發酵技術主要是采用低成本的基質生產低附加值的產品,因此生產中用于在線測定的傳感器必須成本低、可靠性高和易于維護,可在線安裝使用而又不能過于昂貴。在本文所述的檢測方法中,可用電流傳感器在線檢測除 pH之外的環境變量 (溫度、濕度、氧氣),工業上最有前途的傳感器包括氣體傳感器尤其是小型氣相色譜(GCs)、照像技術和微波傳感器,而近紅外(N I R)傳感器難以用作固態發酵生產的在線檢測。

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Sensors in the detecting of solid-state fermentation

YANG Zuo-yi1,L IL i2
(1.Faculty of Environmental Science and Engineering,GuangdongUniversity of Technology,Guangzhou 510006,China; 2.Research Center of Food Protein Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

De tec tion of va ria tiona lp a ram e te rs is s ignifica tive for the solid s ta te fe rm enta tion(SSF),but the de tec ting is d ifficult because of the va riab le and comp licacy subs tra tein SSF.D iffe rent sensors we re d iscussed in the m easurem ent of environm enta l p a ram e te rs(temp e ra ture,pH,wa te r content and ac tivity)and the ca rbon cyc le (b iom ass,subs tra te concentra tion,CO2)in SSF.App lica tion of new techniques and p otentia l techniques(X-rays, M agne tic Resonance I m ag ing,e t a l.)of m ore recentm e thods in the on-line de tec tion we re introduced.

solid s ta te fe rm enta tion;sensor;on-line de tec tion

TS201.1

A

1002-0306(2010)01-0402-04

固態發酵 (SSF)是在低濕含量 (aw)的固態培養基上(一般為 0.40～0.90),在不腐爛和自然狀態下進行的發酵過程。自從 1940年青霉素引起液體深層發酵(SmF)技術的迅速發展以來,SSF長期受到未引起人們的重視,而近年來 SSF在食品、燃料、酶、動物飼料的生產和染料降解等領域的應用越來越多。在生物反應器設計和操作中,環境參數的監測對于固態發酵中生物量和/或代謝物的生產具有重要意義,但由于SSF的培養基物質通常來源于農作物,未經精制使得生產的重現性差,SSF的復雜性和固體培養基的異質性使得各種變量的探測和衡量比 SmF更加困難。傳感器是基于物理、化學或生物的原理,感應生產環境條件的變化并將有用信號傳送到顯示單元,最常見的形式是對電信號進行傳送或顯示。傳感器主要有三種測定方式:樣品不用從反應器中取出,信號由傳感器直接在線測定;傳感器安裝在生產環境附近,需要通過取樣系統或從反應器中取出樣品進行分析,通常這種方式使用較多;離線分析,也稱測量/檢測系統或分析儀。傳感器在生產中作為監測和控制關鍵部件,常會出現誤差而需要矯正。

2009-01-19

楊佐毅(1976-),男,博士,講師,研究方向:環境生物技術。

廣東工業大學博士基金資助(073018)。